鄭菊 劉雨霞,2 張文萍 吳昌學(xué) 李毅 齊曉嵐 官志忠 肖雁

(1貴州醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)重點實驗室 地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550004;2贛南醫(yī)學(xué)院贛南醫(yī)學(xué)炎癥與免疫中心；3貴州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報編輯部)

血管性癡呆(VD)指各種腦血管疾病引起的腦功能障礙而產(chǎn)生引起的后天性智力障礙綜合征，占老年癡呆的49%，發(fā)病率僅次于阿爾茨海默病〔1〕。腦卒中后缺血-再灌注(I/R)是誘發(fā)VD的主要原因之一。腦缺血主要是神經(jīng)元供應(yīng)的能量減少，低能量破壞神經(jīng)元正常蛋白質(zhì)的折疊，導(dǎo)致蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊或錯誤折疊，未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)一旦累積，它們將激活跨膜受體以誘導(dǎo)未折疊的蛋白反應(yīng)(UPR)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)〔2〕。對于這種疾病，恢復(fù)血液供應(yīng)通常作為主要治療方法，然而，恢復(fù)血液供應(yīng)不可避免地導(dǎo)致I/R損傷〔3〕。目前，腦I/R損傷主要包括以下幾個方面：酸中毒，氧自由基釋放，細(xì)胞內(nèi)鈣超載，氧化應(yīng)激，細(xì)胞凋亡和炎癥性損傷再灌注期間損傷也能導(dǎo)致UPR及ERS。研究證實未折疊反應(yīng)能夠緩解ERS，但是當(dāng)UPR不能緩解ERS時會引起細(xì)胞凋亡甚至死亡〔4〕。本研究中我們對腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤(PC12)細(xì)胞體外構(gòu)建氧糖剝奪(OGD)再灌注(OGD/R)模型，模擬腦I/R損傷的神經(jīng)元損傷，觀察神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)關(guān)鍵蛋白葡萄糖蛋白(GRP)78和蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)及凋亡蛋白半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3隨著OGD不同時間段再灌注24 h的變化，探討OGD/R后ERS的發(fā)生與細(xì)胞凋亡的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞 大鼠PC12細(xì)胞系購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所。

1.1.2試劑 改良伊戈爾高糖培養(yǎng)基(DMEM)高糖培養(yǎng)基、無糖的DMEM、0.25%胰酶消化液均購自Gibco公司；胎牛血清購自BI公司；GRP78抗體、caspase-3抗體及辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗兔二抗均購于CST公司；聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白定量試劑、超敏電化學(xué)發(fā)光液(ECL-Plus)購于Thermo Fisher Scientific公司；Annexin V-FITC、PI凋亡試劑購于BD公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜購于Millipore公司；細(xì)胞裂解液(RAPI)及蛋白酶抑制劑(PMSF)均購自CST公司。4',6-二-2-苯基吲哚(DAPI)購自碧云天。

1.1.3儀器 ELX800UV 酶標(biāo)儀，Bio-Tec公司；Western印跡跑膠裝置電源，北京百晶科技公司；GeneGnome XRQ 化學(xué)發(fā)光成像儀，SYNGENE公司；FACS Verse 流式細(xì)胞儀，BD公司；正置熒光顯微鏡，日本尼康。

1.2方法

1.2.1PC12細(xì)胞培養(yǎng)及分組 按89∶10∶1(DMEM∶血清∶雙抗)比例配成完全培養(yǎng)基，取凍存的PC12細(xì)胞懸液加入含有3 ml完全培養(yǎng)基培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h換液。培養(yǎng)2～4 d傳代；待第二代細(xì)胞均勻鋪滿80%，取1×106個/孔種板于6孔板中。待第三代PC12細(xì)胞處于對數(shù)生長期時對細(xì)胞進(jìn)行OGD/R。根據(jù)OGD的時間不同，將細(xì)胞分為五個組：control、3 h/24 h(OGD 3 h再灌注12 h)組、6 h/24 h(OGD 6 h再灌注24 h)組、9 h/24 h(OGD 9 h再灌注24 h)組、12 h/24 h(OGD 12 h再灌注24 h)組。

1.2.2PC12細(xì)胞OGD/R模型制備 49.5 ml無糖DMEM中添加入500 μl雙抗，配成含有1%雙抗的無糖培養(yǎng)基。取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行OGD：棄去板內(nèi)完全培養(yǎng)基，1×磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，再用無糖培養(yǎng)基洗1次，每孔加入無糖培養(yǎng)基2 ml。將六孔板置于37℃，1%O2，5%CO2，94%N2的三氣培養(yǎng)箱中進(jìn)行OGD(control組用1×PBS洗后每孔加入2 ml完全培養(yǎng)基，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng))，剝奪相應(yīng)的時間段(3、6、9、12 h)后，棄去無糖培養(yǎng)基，1×PBS洗3次，換2 ml完全培養(yǎng)基，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中復(fù)糖復(fù)氧培養(yǎng)24 h。

1.2.3細(xì)胞凋亡率檢測 模型制備好后，根據(jù)流式試劑盒說明書處理細(xì)胞，用預(yù)冷的1×PBS洗2次，不含二氨基乙烷四乙酸(EDTA)的胰酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞。1×PBS洗滌細(xì)胞離心1 000 r/min/5 min后棄掉上清液，用蒸餾水將10×結(jié)合緩沖液稀釋為1×結(jié)合緩沖液，向每管細(xì)胞中加入100 μl 1×結(jié)合緩沖液，然后向每管細(xì)胞中分別加入5 μl Annexin V-FITC及5 μl PI，PI單染組加入5 μl PI,Annexin V-FITC單染組加入5 μl FITC，所有細(xì)胞均避光染色15 min。最后向每管細(xì)胞中加入400 μl 1×結(jié)合緩沖液，混勻過濾并1 h內(nèi)上機。

1.2.4Western印跡檢測細(xì)胞中GRP78、PERK、caspase-3的表達(dá) 模型制備同上，用預(yù)冷的1×PBS洗3次，每個孔加入100 μl的裂解液,用雙蒸水將10×RAPI稀釋為1×RAPI，按PMSF:RAPI=1∶100的比例加入PMSF，放在冰上裂解1 h,14 000 r/min離心10 min收集上清液。BCA蛋白定量法測定蛋白濃度，運用Western印跡法檢測各組細(xì)胞中GRP78、PERK、caspase-3蛋白表達(dá)水平及其內(nèi)參的蛋白表達(dá)情況，GeneGnome XRQ中曝光，Image J軟件分析條帶灰度值。

1.2.5免疫熒光檢測 將PC12細(xì)胞以5×104個/孔種植在放有爬片的12孔板中，待細(xì)胞長到80%后模型制備同上。用預(yù)冷的1×PBS洗3次并用4%的多聚甲醛固定15 min。然后用0.25%Triton X-100使細(xì)胞通透10 min，室溫下用1×PBS緩沖液配置3%牛血清白蛋白封閉30 min。將細(xì)胞加入GRP78(1∶200)抗體4℃孵育過夜，次日孵育熒光二抗1 h，洗滌載玻片并用DAPI染色細(xì)胞核，最后正置熒光顯微鏡下拍攝熒光圖片。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行方差分析，Spearman相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1OGD/R后PC12細(xì)胞中GRP78蛋白的表達(dá) 用OGD/R模擬I/R損傷，檢測不同時間段中細(xì)胞GRP78蛋白的表達(dá)水平來反映ERS，選取了OGD 5個不同時間段(0、3、6、9、12 h，其中0 h是control組)并再灌注24 h。Western印跡結(jié)果顯示，β-actin為內(nèi)參，與control組相比較，6 h/24 h、9 h/24 h、12 h/24 h這三個時間段的GRP78蛋白的表達(dá)水平明顯增加(P<0.01，P<0.05)，6 h/24 h組GRP78蛋白的表達(dá)水平升高最為明顯，表明OGD/R成功誘導(dǎo)ERS。與3 h/24 h組相比較，6 h/24 h、9 h/24 h、12 h/24 h組的GRP78蛋白表達(dá)水平增加(P<0.01，P<0.05)。在此結(jié)果的基礎(chǔ)上，挑選control組和6 h/24 h組做免疫熒光，用正置熒光顯微鏡直接觀察GRP78蛋白的表達(dá)量，與control組比較，6 h/24 h組中GRP78蛋白的表達(dá)量增多。見圖 1、圖2及表1。

圖1 OGD/R后PC12細(xì)胞中GRP78蛋白的表達(dá)

綠光為GRP78，藍(lán)光為細(xì)胞核圖2 GRP78蛋白熒光圖(×400)

表1 各組細(xì)胞GRP78、PERK、caspase-3蛋白表達(dá)水平及凋亡率

與control組相比：1)P<0.05,2)P<0.01;與3 h/24 h組相比：3)P<0.05,4)P<0.01

2.2OGD/R后PC12細(xì)胞中PERK蛋白的表達(dá) 應(yīng)用Western印跡檢測OGD/R各組細(xì)胞中PERK蛋白，結(jié)果顯示，各個實驗組與control 組比較均無明顯差異(P>0.05)。見表1、圖3。

2.3OGD/R后PC12細(xì)胞中caspase-3蛋白的表達(dá) OGD/R后caspase-3蛋白的表達(dá)水平，與Control組相比較，6 h/24 h、9 h/24 h、12 h/24 h這三個時間段 caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著增加(P<0.01),與3 h/24 h相比較,6 h/24 h、9 h/24 h、12 h/24 h 這三個時間段caspase-3蛋白的表達(dá)水平顯著增加(P<0.01)。見表1、圖4。

2.4流式細(xì)胞儀Annexin V-FITC、PI染色法檢測細(xì)胞凋亡 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡在四個象限中進(jìn)行(Q4：死細(xì)胞;Q3：晚期凋亡細(xì)胞;Q2：早期凋亡細(xì)胞,Q1：正常細(xì)胞)。細(xì)胞凋亡率是Q2和Q3中凋亡細(xì)胞的百分比之和。與control組比較，3 h/24 h、6 h/24 h、9 h/24 h、12 h/24 h組凋亡率增加(P<0.01)，與3 h/24 h組比較，6 h/24 h、9 h/24 h、12 h/24 h凋亡率明顯增加(P<0.01)。見表1、圖5。

2.5GRP78蛋白與caspase-3蛋白表達(dá)的相關(guān)性 GRP78蛋白與caspase-3蛋白在OGD/R24 h的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.562，P<0.05)。見圖6。

圖3 OGD/R后PC12細(xì)胞中PERK蛋白的表達(dá)

圖4 OGD/R后PC12細(xì)胞中caspase-3蛋白的表達(dá)

圖5 PC12細(xì)胞凋亡檢測

圖6 PC12細(xì)胞中GRP78蛋白與caspase-3蛋白表達(dá)相關(guān)性

3 討 論

VD 是由于缺血或出血性腦血管病及全腦缺血、缺氧引起的認(rèn)知障礙，主要是由于記憶和認(rèn)知功能缺損為主，可伴有語言、運動、視空間技能及人格障礙〔5〕。大部分VD是由腦缺血引起，盡管大腦只占了總體重的2%左右，但它消耗的體內(nèi)氧氣幾乎占20%，因此大腦對缺氧缺糖特別敏感，一旦發(fā)生腦缺血將引起血液供應(yīng)不足導(dǎo)致氧和葡萄糖剝奪，限制了能量產(chǎn)生所必需基質(zhì)葡萄糖和氧氣向大腦的輸送，減少了三磷酸腺苷(ATP)的合成，造成低能量擾亂正常蛋白質(zhì)的折疊，最終就會導(dǎo)致ERS和細(xì)胞凋亡〔6,7〕。有文獻(xiàn)研究表明大鼠缺血2 h后灌注不同時間用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)對大鼠腦切片進(jìn)行染色，大鼠腦切片的TTC染色顯示出不同程度的梗死，主要在紋狀體和皮質(zhì)中，再灌注早期時間點(即0 h,3 h和6 h)的損傷僅限于紋狀體，然而，隨著再灌注時間點的增加，它延伸到皮質(zhì)區(qū)域，觀察到最大的梗死出現(xiàn)在再灌注24 h〔8〕。近幾年，腦I/R引起的ERS和凋亡是基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究的熱點之一。

腦I/R時引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+的儲存耗竭和氧化應(yīng)激激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，一旦內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激被激活，PERK與GRP78由緊密結(jié)合狀態(tài)解離〔9〕。相關(guān)文獻(xiàn)報道在創(chuàng)傷性大腦損傷中，GRP78的表達(dá)隨著時間的延長先升高再減少〔10〕，與本研究結(jié)果一致，而在3 h/24 h組中GRP78沒有明顯變化，可能缺血3 h對PC12細(xì)胞是一個短暫性的亞致死性時間，再灌注不會導(dǎo)致太大的損傷。GRP78在缺血性腦中表達(dá)是上升的，同時，GRP78蛋白的表達(dá)增加標(biāo)志著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生，本研究表明6 h/24 h時引起了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。PERK 屬于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 PERK/elF2α 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的啟動蛋白，并被胞質(zhì)內(nèi)結(jié)構(gòu)域的自身二聚化和磷酸化激活〔11〕，在本實驗中PERK蛋白的表達(dá)無明顯變化。另外，腦缺血再灌注的過程中由于大量自由基的產(chǎn)生氧化細(xì)胞膜的磷脂中不飽和脂肪酸導(dǎo)致膜損傷，隨后通過壞死或凋亡模式導(dǎo)致的細(xì)胞死亡〔12〕。caspase和Bcl-2家族成員在調(diào)節(jié)I/R期間啟動的多種細(xì)胞凋亡途徑中是至關(guān)重要的，對caspase敲除小鼠的研究為caspase在神經(jīng)細(xì)胞死亡中的關(guān)鍵作用提供了無可爭辯的證據(jù)，缺乏caspase-3和caspase-9的小鼠顯示出神經(jīng)細(xì)胞凋亡不容易發(fā)生〔13〕。本研究結(jié)果表明隨著OGD時間的延長細(xì)胞的凋亡率逐漸增加，呈動態(tài)變化。有研究表明缺血2 h再灌注0.5 h，視前區(qū)的缺血區(qū)部分凋亡細(xì)胞，隨著再灌注時間的延長，凋亡細(xì)胞散在分布于大腦的各個區(qū)域；再灌注12 h凋亡細(xì)胞數(shù)量達(dá)到高峰；持續(xù)再灌注24 h，此時可見凋亡細(xì)胞的各種形態(tài)〔14〕，說明了細(xì)胞凋亡是一個動態(tài)的發(fā)展過程。

GRP78蛋白的表達(dá)增加標(biāo)志著OGD再灌注能夠引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生，但同時GRP78是一種分子伴侶能夠減少細(xì)胞的凋亡〔15〕，但隨著OGD時間延長，導(dǎo)致應(yīng)激強度增加，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能遭到破壞，GRP78的表達(dá)不但沒有繼續(xù)升高，反而下降，就會引起細(xì)胞的凋亡不斷增加。