曾祥如，雷雨婷，姜依何，任春梅,2*

擬南芥基因突變對苯丙氨酸誘導花青素積累的影響

曾祥如1，雷雨婷1，姜依何1，任春梅1,2*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學生物科學技術(shù)學院，湖南 長沙 410128；2.作物基因工程湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128)

為探索花青素生物合成的調(diào)控機制，以模式植物擬南芥野生型Col–0和酪氨酸降解途徑缺陷突變體為試驗材料，分析5種濃度(0、0.1、0.5、1.0、2.0 mmol/L)外源苯丙氨酸處理后花青素的積累和花青素生物合成相關(guān)基因的表達，探討酪氨酸降解途徑受阻是否影響苯丙氨酸誘導花青素的積累。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：外源添加不同濃度苯丙氨酸能提高擬南芥幼苗花青素的含量，而且花青素的含量隨著苯丙氨酸濃度的增加而增多；苯丙氨酸處理后，突變體幼苗中花青素的積累增多，同時花青素生物合成基因，如、、、、、的表達水平在突變體中都顯著上調(diào)，表明基因突變會阻斷酸酪氨酸降解，增加苯丙氨酸誘導花青素的合成。

擬南芥；花青素；苯丙氨酸；基因；突變體；酪氨酸降解途徑

花青素是植物中常見的一種天然色素，主要存在于植物器官的表皮細胞，在植物抗逆、防御病蟲害、育花、育種以及維持植物內(nèi)部環(huán)境的穩(wěn)定等方面都發(fā)揮著重要作用[1–2]。花青素經(jīng)兩部分合成：第一部分是花青素生物合成上游，花青素合成底物苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶(PAL)、查爾酮合成酶(CHS)、查耳酮異構(gòu)酶(CHI)等多種酶的作用下形成中間代謝物二氫黃酮醇；第二部分是花青素生物合成下游，二氫黃酮醇在二氫黃酮醇還原酶(DFR)、花青素合成酶(LDOX)、黃酮3,5–糖苷轉(zhuǎn)移酶(UFGT)等多種酶的催化下形成穩(wěn)定的花色素[3–4]。

酪氨酸降解途徑是動物必需的代謝途徑，苯丙氨酸可以在動物體內(nèi)轉(zhuǎn)化為酪氨酸進行降解[5]。HAN等[6]發(fā)現(xiàn)，植物中酪氨酸降解也具有生物功能，編碼擬南芥酪氨酸降解途徑的基因突變能導致短日照下細胞死亡。湯睿等[7]的研究結(jié)果表明，在長日照下酪氨酸也可以進行降解。然而，植物中苯丙氨酸是否轉(zhuǎn)化為酪氨酸進行降解尚不清楚。苯丙氨酸是花青素的合成前體，如果苯丙氨酸在植物中可轉(zhuǎn)化成酪氨酸進行降解，那么，由于阻斷了酪氨酸降解，基因突變會減少苯丙氨酸轉(zhuǎn)化成酪氨酸，從而增加苯丙氨酸誘導花青素的積累。本研究中，以突變體為試驗材料，野生型Col–0為對照，通過苯丙氨酸處理，采用植物生理學方法檢測花青素含量，并以分子生物學方法檢測花青素生物合成關(guān)鍵基因的表達，探究酪氨酸降解途徑受阻是否影響苯丙氨酸誘導花青素的合成。

1　材料與方法

1.1　材料

擬南芥()野生型Columbia (Col–0)和突變體種子均由作物基因工程湖南省重點實驗室植物信號傳導課題組提供。

1.2　主要試劑與儀器

苯丙氨酸；種子消毒液(20% Bleach + 0.1% Triton X–100)；花青素提取液(18% 正丙醇，1% HCl，81% ddH2O)；Bio–RAD CFX connectTMoptics Module型熒光定量PCR儀；UV–1700型紫外分光光度計；人工氣候箱PRX–450B。

1.3　試驗方法

1.3.1擬南芥幼苗的培養(yǎng)

將擬南芥Col–0及突變體種子在消毒液中浸泡10 min，用超純水清洗4～5遍后，鋪種于含1% 蔗糖的MS固體培養(yǎng)基上，4 ℃下春化處理3 d，置于人工氣候箱(16 h光照/8 h黑暗)中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度(22 ± 2) ℃，光照度80～120 lx，相對濕度65%。

1.3.2花青素相對含量的測定

將在MS培養(yǎng)基上生長7 d的Col–0及小苗分別轉(zhuǎn)移至含5種濃度(0、0.1、0.5、1.0、2.0 mmol/L)苯丙氨酸的MS培養(yǎng)基上繼續(xù)生長7 d。根據(jù)DEIKMAN等[8]的方法測定擬南芥幼苗中花青素的含量。隨機選取苯丙氨酸處理后的材料，每個處理6個樣品，每個樣品取10株幼苗。吸干樣品上的水分，測得材料鮮質(zhì)量，置于裝有1 mL花青素提取液的EP管中。沸水浴3 min后，室溫下黑暗過夜。用UV-–1700型紫外分光光度計測定處理樣品在535 nm和650 nm的吸收值，花青素相對含量為每克植物材料在535nm和650nm吸光值的差值。3次重復。試驗誤差用SE表示。

1.3.3RNA提取與qRT–PCR分析

將在MS培養(yǎng)基上生長7 d的Col–0及小苗轉(zhuǎn)移至含2 mmol/L苯丙氨酸的MS培養(yǎng)基上繼續(xù)生長7 d，隨機分別摘取Col–0及幼苗的新鮮葉片100 mg，通過Trizol法提取材料總RNA。采用羅氏SYBR qPCR Mix 熒光定量試劑盒進行qRT–PCR分析。具體操作按湯睿等[9]的方法進行，以兩步法程序在熒光定量PCR儀(Bio–RAD CFX connectTMoptics Module)上完成。qRT–PCR內(nèi)參基因為，引物序列見表1。

表1　qRT–PCR引物序列

1.4　數(shù)據(jù)分析

采用2–ΔΔCt法對基因表達數(shù)據(jù)進行分析。

2　結(jié)果與分析

2.1　SSCD1基因突變對苯丙氨酸誘導花青素積累的影響

為探究基因突變對苯丙氨酸誘導擬南芥幼苗花青素積累的影響，用5種濃度(0、0.1、0.5、1.0、2.0mmol/L)苯丙氨酸分別處理擬南芥野生型(Col–0)和突變體幼苗，結(jié)果如圖1所示。當苯丙氨酸濃度為0、0.5 mmol/L時，突變體與野生型幼苗顏色無明顯差別；用1.0 mmol/L苯丙氨酸處理后，植株莖稈和葉片背面開始出現(xiàn)淡紫色花青素的積累，突變體葉片的顏色略深于野生型的；苯丙氨酸濃度增至2.0 mmol/L時，突變體幼苗背面和莖稈的紫色面積擴大，呈深紫色，顏色明顯深于野生型的。

為更明確地了解苯丙氨酸處理后擬南芥野生型和突變體的花青素積累，對其花青素相對含量進行了測定，結(jié)果如圖2所示。當苯丙氨酸濃度為0、0.1 mmol/L時，突變體中花青素的相對含量較低，與野生型的無明顯差異；當苯丙氨酸濃度為0.5 mmol/L時，突變體中花青素相對含量相比野生型的稍有上升；當苯丙氨酸濃度為1.0 mmol/L時，突變體中花青素相對含量顯著高于野生型的(<0.05)；當苯丙氨酸濃度為2.0 mmol/L時，二者具有極顯著差異(<0.01)。以上結(jié)果表明，基因突變能促進苯丙氨酸誘導花青素的積累。

a、b、c、d分別為苯丙氨酸濃度為0、0.5、1.0、2.0 mmol/L時擬南芥野生型Col–0的表型；e、f、g、h分別為苯丙氨酸濃度為0、0.5、1.0、2.0 mmol/L時擬南芥突變體sscd1的表型。

“*”表示在0.05水平下差異顯著；“**”表示在0.01水平下差異極顯著。

2.2　SSCD1基因突變對苯丙氨酸誘導花青素生物合成上游基因表達的影響

采用qRT–PCR對花青素生物合成上游基因和的表達進行分析(圖3)，發(fā)現(xiàn)未添加苯丙氨酸時，擬南芥突變體中這些基因的表達量較低，與野生型無明顯差異；經(jīng)苯丙氨酸處理后，突變體和野生型(Col–0)幼苗中3個基因的表達量均顯著增加，且在突變體中的表達量顯著高于野生型的(< 0.05)，說明苯丙氨酸能誘導花青素生物合成上游基因的表達，基因突變能上調(diào)苯丙氨酸誘導花青素生物合成上游基因的表達。

CK為未經(jīng)苯丙氨酸處理的對照組；phe為經(jīng)2.0 mmol/L苯丙氨酸處理的試驗組。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3　SSCD1基因突變對苯丙氨酸誘導花青素生物合成下游基因表達的影響

對花青素生物合成下游基因、、進行測定，結(jié)果(圖4)發(fā)現(xiàn)，未添加苯丙氨酸時，擬南芥突變體中、、基因的表達量相比野生型的無顯著差別；經(jīng)苯丙氨酸處理后，這些基因的表達量均顯著增加，在突變體中的表達量顯著高于野生型對照的(<0.05)。說明苯丙氨酸可誘導花青素生物合成下游基因的表達，而基因突變會增強苯丙氨酸的誘導作用。

CK為未經(jīng)苯丙氨酸處理的對照組；phe為經(jīng)2.0 mmol/L苯丙氨酸處理的試驗組。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

3　結(jié)論與討論

苯丙氨酸參與植物次生代謝途徑，并在一系列酶的作用下合成花青素及黃酮類物質(zhì)，對植物生長具有重大意義[10]。在新疆紫草中，L–苯丙氨酸可顯著促進毛狀根中花青素的積累[11]。本研究中，外源添加不同濃度苯丙氨酸能提高擬南芥幼苗花青素的含量，而且花青素的含量隨著苯丙氨酸濃度的增加而增多。對花青素合成的關(guān)鍵基因進行qRT–PCR分析，發(fā)現(xiàn)苯丙氨酸處理能上調(diào)花青素生物合成的上游和下游基因的表達，進一步驗證了苯丙氨酸能調(diào)控植物中花青素的合成。

ZHOU等[12]的研究結(jié)果表明，酪氨酸處理擬南芥幼苗可誘導花青素的積累，但編碼酪氨酸降解途徑最后一個酶的基因突變后會降低酪氨酸誘導花青素的積累。突變會產(chǎn)生酪氨酸降解途徑的異常代謝產(chǎn)物(琥珀酰丙酮)，體內(nèi)積累較多琥珀酰丙酮會對生物產(chǎn)生毒害作用[13–14]。外源酪氨酸處理會加速酪氨酸降解，從而增加琥珀酰丙酮在突變體中的積累，推測可能是因為琥珀酰丙酮的毒害影響了酪氨酸誘導花青素的生物合成。尿黑酸是酪氨酸降解途徑的中間產(chǎn)物[15]，湯睿等[9]研究發(fā)現(xiàn)，外源尿黑酸處理能誘導花青素的合成，并且在突變體中外源尿黑酸誘導合成的花青素增多，說明基因突變阻礙了尿黑酸經(jīng)酪氨酸降解途徑進行降解，從而增加了尿黑酸誘導花青素的積累。苯丙氨酸在動物中可轉(zhuǎn)化為酪氨酸進行降解[16]。雷雨婷等[17]發(fā)現(xiàn)，外源苯丙氨酸處理更明顯地抑制突變體的幼苗生長，說明在植物中苯丙氨酸也有可能轉(zhuǎn)化成酪氨酸進行降解。苯丙氨酸是花青素的合成底物。本研究中，苯丙氨酸處理后突變體的花青素積累以及花青素生物合成上游和下游基因的表達都高于野生型，說明在野生型擬南芥中外源處理的苯丙氨酸除了用于花青素的合成，還有一部分轉(zhuǎn)化成酪氨酸進行降解，而在突變體中，由于酪氨酸降解途徑受阻，苯丙氨酸難以通過轉(zhuǎn)化成酪氨酸進行降解；因此，苯丙氨酸處理后突變體幼苗合成的花青素要高于野生型的。該研究結(jié)果說明基因突變，可阻礙酪氨酸降解，增加苯丙氨酸誘導花青素的積累，也證明了在植物中苯丙氨酸可以轉(zhuǎn)化成酪氨酸進行降解。

[1] WINKEL-SHIRLEY B．Flavonoid biosynthesis：a colorful model for genetics，biochemistry，cell biology，and biotechnology[J]．Plant Physiology，2001，126(2)：485–493．

[2] 胡可，韓科廳，戴思蘭．環(huán)境因子調(diào)控植物花青素苷合成及呈色的機理[J]．植物學報，2010，45(3)：307–317．

HU K，HAN K T，DAI S L．Regulation of plant anthocyanin synthesis and pigmentation by environmental factors[J]．Chinese Bulletin of Botany，2010，45(3)：307–317．

[3] HOLTON T A，CORNISH E C．Genetics and biochemistry of anthocyanin biosynthesis[J]．The Plant Cell，1995：1071–1083．

[4] 侯夫云，王慶美，李愛賢，等．植物花青素合成酶的研究進展[J]．中國農(nóng)學通報，2009，25(21)：188–190．

HOU F Y，WANG Q M，LI A X，et al．Study progress on anthocyanidin synthase of plants[J]．Chinese Agricultural Science Bulletin，2009，25(21)：188–190．

[5] LINDBLAD B，LINDSTEDT S，STEEN G．On the enzymic defects in hereditary tyrosinemia[J]．Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1977，74(10)：4641–4645．

[6] HAN C Y，REN C M，ZHI T T，et al．Disruption of fumarylacetoacetate hydrolase causes spontaneous cell death under short-day conditions in[J]．Plant Physiology，2013，162(4)：1956–1964．

[7] 湯睿，雷雨婷，周舟，等．尿黑酸對擬南芥酪氨酸降解缺陷突變體的影響[J]．生命科學研究，2018，22(1)：14–18．

TANG R，LEI Y T，ZHOU Z，et al．The effect of homogentisate on tyrosine pathway-deficientmutant of[J]．Life Science Research，2018，22(1)：14–18．

[8] DEIKMAN J，HAMMER P E．Induction of anthocyanin accumulation by cytokinins in[J]. Plant Physiology，1995，108(1)：47–57．

[9] 湯睿，雷雨婷，任春梅．外源尿黑酸對擬南芥幼苗花青素生物合成的影響[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學學報(自然科學版)，2019，45(1)：37–41．

TANG R，LEI Y T，REN C M．Effect of exogenous homogentisate on anthocyanin biosynthesis inseedlings[J]．Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences)，2019，45(1)：37–41．

[10] 王星，羅雙霞，于萍，等．茄科蔬菜苯丙烷類代謝及相關(guān)酶基因研究進展[J]．園藝學報，2017，44(9)：1738–1748．

WANG X，LUO S X，YU P，et al．Advances in phenylaprapanoid metabolism and its enzyme genes in Solanaceae vegetables[J]．Acta Horticulturae Sinica，2017，44(9)：1738–1748．

[11] 葛素囡，張生翾，王芳，等．外源物質(zhì)對新疆紫草毛狀根次生代謝產(chǎn)物含量的影響[J]．食品科學，2016，37(9)：160–164．

GE S N，ZHANG S X，WANG F，et al．Effects of exogenous substances on the content of secondary metabolites injohnst hairy roots[J]. Food Science，2016，37(9)：160–164．

[12] ZHOU Z，ZHI T T，LIU Y，et al．Tyrosine induces anthocyanin biosynthesis in[J]. American Journal of Plant Sciences，2014，5(3)：328–331．

[13] ZHOU L Z，YANG Z G，ZHI T T，et al．A GC/MS method for determination of succinylacetone in[J]．Analytical and Bioanalytical Chemistry，2016，408(17)：4661–4667．

[14] ZHI T T，ZHOU Z，QIU B，et al．Loss of fumarylacetoacetate hydrolase causes light-dependent increases in protochlorophyllide and cell death in[J]．The Plant Journal，2019，98(4)：622–638．

[15] DIXON D P，EDWARDS R．Enzymes of tyrosine catabolism in[J]．Plant Science，2006，171(3)：360–366．

[16] LERNER A B．On the metabolism of phenylalanine and tyrosine[J]．The Journal of Biological Chemistry，1949，181(1)：281–294．

[17] 雷雨婷，湯睿，任春梅．苯丙氨酸處理對擬南芥酪氨酸降解途徑的影響[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學學報(自然科學版)，2018，44(4)：365–368．

LEI Y T，TANG R，REN C M．Effects of phenylalanine on tyrosine degradation pathway inseedlings[J]．Journal of Hunan Agricultural University (Natural Sciences)，2018，44(4)：365–368．

Effects ofmutation on phenylalanine-induced anthocyanin accumulation in

ZENG Xiangru1，LEI Yuting1，JIANG Yihe1，REN Chunmei1,2*

(1.College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha, Hunan 410128, China; 2.Crop Gene Engineering Key Laboratory of Hunan Province, Changsha, Hunan 410128, China)

In this paper, the model plantwild type Col-0 and tyrosine degradation pathway defective mutantwere used as experimental materials to explore the regulatory mechanism of anthocyanin biosynthesis, to analyze the accumulation of anthocyanin and anthocyanin biosynthesis related gene expression after treatment with exogenous phenylalanine, and to explore whether the blocked tyrosine degradation pathway affect phenylalanine-induced anthocyanin accumulation. The results showed that the accumulation of anthocyanins inmutant seedlings increased after phenylalanine treatment, meanwhile, the expression levels of anthocyanin biosynthetic genes including,,,,andwere significantly upregulated inmutants. This results indicated that blocking tyrosine degradation bygene mutation could increase the synthesis of anthocyanin.

; anthocyanin; phenylalanine;gene;mutant; tyrosine degradation pathway

10.13331/j.cnki.jhau.2020.01.006

Q786

A

1007-1032(2020)01-0033-05

2019–05–23

2019–06–28

國家“973”計劃前期研究專項(2014CB160308)

曾祥如(1996—)，女，新疆瑪納斯人，碩士研究生，主要從事植物分子遺傳學研究，1719809744@qq.com；

，任春梅，博士，教授，主要從事植物分子遺傳學研究，rencm66@163.com

曾祥如，雷雨婷，姜依何，任春梅．擬南芥基因突變對苯丙氨酸誘導花青素積累的影響[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學學報(自然科學版)，2020，46(1)：33–37．

ZENG X R，LEI Y T，JIANG Y H，REN C M. Effects ofmutation on phenylalanine-induced anthocyanin accumulation in[J]．Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences), 2020, 46(1): 33–37.

http://xb.hunau.edu.cn

責任編輯：毛友純

英文編輯：柳正