劉云云，李智敏，程毅，余永廷，陳佳，嚴準

玉米瘤黑粉菌SG200效應蛋白PEP1表達及生物信息學分析

劉云云，李智敏，程毅，余永廷，陳佳，嚴準*

(中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究所，湖南 長沙 410205)

運用生物信息學手段分析基因結(jié)構(gòu)，并根據(jù)GenBank中玉米瘤黑粉菌DNA序列設(shè)計引物，從玉米瘤黑粉菌SG200的基因組中擴增得到了基因全長，構(gòu)建了pET–28a–重組表達質(zhì)粒，選用大腸埃希菌BL21(DE3)作為宿主菌，以1 mmol/L IPTG誘導表達。SDS–PAGE檢測結(jié)果表明，誘導表達產(chǎn)物大小與理論值(20 800)一致，說明pET–28a–能夠在大腸埃希菌BL21(DE3)中高效表達。

玉米瘤黑粉菌；SG200菌株；效應蛋白PEP1；生物信息學分析

玉米瘤黑粉菌()是引發(fā)玉米瘤黑粉病的病原真菌，屬于擔子菌門、黑粉菌目[1]。玉米黑粉菌能夠侵染植株的各個部位，引起植株感病，一旦大面積發(fā)病就會引起玉米大量減產(chǎn)，造成嚴重的經(jīng)濟損失[2]；因此，對玉米瘤黑粉菌的研究具有重要意義。玉米瘤黑粉菌的基因組在2006年被測序[3]，本研究中的基因位于玉米黑粉菌的3號染色體上，PEP1蛋白由178個氨基酸組成，經(jīng)預測，N端1～26個氨基酸肽段為分泌信號肽[4]。PEP1是玉米瘤黑粉菌分泌的一種效應蛋白[5]，當被刪除后，玉米瘤黑粉菌無法入侵植物細胞，也無法與宿主建立兼容的相互關(guān)系[6]。本試驗中，在玉米瘤黑粉菌SG200中克隆了基因，與pET–28a連接，探索其在大腸埃希菌中是否高效表達，旨為進一步研究玉米瘤黑粉菌基因與其他因子的互作關(guān)系，尋求防治玉米瘤黑粉病的新方法提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1菌種與質(zhì)粒

玉米瘤黑粉菌() SG200、載體pET–28a由中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究所南方經(jīng)濟作物保護實驗室保藏；大腸埃希菌DH5α、大腸埃希菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞購自北京博邁德基因技術(shù)有限公司。

1.1.2酶類與主要試劑

T4連接酶、限制性內(nèi)切酶HⅠ和d Ⅲ均購自Thermo Fisher Scientific；PCR Mix、DNA Maker(DL5000)、DNA提取試劑盒由康為世紀生物科技公司提供；質(zhì)粒提取試劑盒由Promega提供；DNA膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA。蛋白粗提用溶液：1) Buffer A：0.05 mol/L Tris–HCl、0.15 mol/L NaCl、pH 7.5；2) Buffer B：Buffer A 中添加0.5% Triton X–100、0.5 mol/L urea；3) Buffer C：Buffer A 中添加0.5% Triton X–100；4) Buffer D：8 mol/L urea、100 mmol/L NaH2PO4、100 mmol/L Tris–HCl， pH調(diào)至8.0。以上溶液均用純水配置，0.45 μm濾膜過濾除菌。

1.2　方法

1.2.1引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank中玉米瘤黑粉菌DNA序列(Accession XM_011389599.1)，利用Primer Premier 5.0設(shè)計上游引物(5–CGGATGCTGCGGG TGCGGTA–3)和下游引物(5–CCCCATG CCAAACATGCTACCGATT–3)，正向和反向引物分別包含HⅠ和d Ⅲ酶切位點(下劃線標出)。pET–28a載體測序引物為T7(5–TAATACGAC TCACTATAGGG–3)和T7t(5–GCTAGTTATTGCTC AGCGG–3)。引物均由北京擎科生物公司合成。

1.2.2玉米瘤黑粉菌基因克隆

玉米瘤黑粉菌SG200基因組DNA的提取按照真菌DNA提取試劑盒的說明進行。以玉米瘤黑粉菌SG200基因組DNA為模板，PCR擴增基因。擴增程序為：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。擴增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后切膠，回收純化。將純化后的基因片段送擎科生物公司測序，測序結(jié)果與GenBank中玉米瘤黑粉菌DNA序列(Accession XM_0113895 99.1)完全一致。

1.2.3玉米瘤黑粉菌PEP1的生物信息學分析

為進一步分析PEP1的功能與結(jié)構(gòu)的關(guān)系，通過以下幾種在線工具對PEP1的理化性質(zhì)及二級、三級結(jié)構(gòu)進行預測分析。利用SignalP 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測PEP1是否存在信號肽；運用ProtParam在線工具(https:// web.expasy.org/protparam/)預測PEP1編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)；利用 Protscale (http://web.expasy.org/ protscale) 在線軟件對PEP1進行親水性/疏水性分析；利用Psipred (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)進行二級結(jié)構(gòu)預測；運用swiss–model (https:// swissmodel.expasy.org)進行三級結(jié)構(gòu)預測[7]。

1.2.4重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建

將重組質(zhì)粒與純化后的DNA片段用HⅠ和d Ⅲ進行雙酶切(37 ℃水浴10 min，80 ℃ 水浴5 min)。酶切產(chǎn)物純化回收后，將片段和載體連接(16 ℃金屬浴，過夜)，將連接產(chǎn)物用熱激法轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α，利用LB加卡那霉素(100 μg/mL)篩選陽性克隆。挑取陽性菌落，提取重組質(zhì)粒，進行HⅠ和d Ⅲ雙酶切鑒定，送擎科生物公司測序。將雙酶切鑒定結(jié)果與測序結(jié)果正確的重組載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21(DE3)。

1.2.5蛋白質(zhì)誘導表達與檢測

挑取重組菌株單菌落置于含有卡那霉素的1 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃搖床，225 r/min培養(yǎng)4 h，將1 mL菌液接種于10 mL 含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基，37 ℃搖床，225 r/min培養(yǎng)至600達0.6，再加入10 μL 1 mol/L IPTG，使培養(yǎng)基中IPTG的終濃度為1 mmol/L，30 ℃、180 r/min誘導3 h。

以宿主菌BL21(DE3)和含有空載體pET–28a的重組BL21(DE3)菌株作為陰性對照，以含有pET–28a–表達載體的重組BL21(DE3)菌株為陽性對照。1E08是1個小分子抗體[8]，在中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究所南方經(jīng)濟作物保護實驗室中已被熟練誘導表達；因此將它作為pET–28a–/BL21表達的陽性對照。取上述誘導后的10 mL菌液離心(12 000 r/min，5 min)，收集菌體。用化學滲透法破碎細胞[9]，具體步驟如下：用10 mL Buffer A重懸菌體，離心30 min(8 000 r/min)，收集沉淀；加1 mL Buffer C重懸后，28 ℃靜置過夜，離心30 min(8 000 r/min)，收集沉淀；加1 mL Buffer B洗2次，Buffer A洗1次，加1 mL Buffer D溶解沉淀，即獲得蛋白質(zhì)粗提取液；取6 μL 5×上樣緩沖液與24 μL蛋白粗提取液混勻，沸水浴10 min；取上述處理好的蛋白粗提液20 μL于 15%的聚丙烯酰胺變性膠中，進行電泳檢測。

2　結(jié)果與分析

2.1　玉米瘤黑粉菌pep1基因克隆

以玉米瘤黑粉菌SG200基因組DNA為模板，PCR擴增基因，片段大小為456 bp(去除信號肽后)，如圖1。

M為DNA分子量大小標記；泳道1為pep1基因。

2.2　玉米瘤黑粉菌pep1的生物信息學分析

對基因序列進行信號肽分析，結(jié)果(圖2)顯示，編碼的氨基酸在第26個氨基酸處值、值和值達到最高峰，分別為0.710、0.984和0.812，預測此處為信號肽剪切位點。第1～26個氨基酸平均值為0.930，值為0.876，預測第1～26個氨基酸為信號肽。對PEP1進行理化性質(zhì)分析，發(fā)現(xiàn)編碼的氨基酸為178個，相對分子質(zhì)量為18 444.72，理論等電點為5.45。在組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸中，甘氨酸(Gly)所占比例最高，為11.2%，其中帶有負電荷的氨基酸多于帶有正電荷的氨基酸，蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定系數(shù)為28.25，屬于穩(wěn)定蛋白。PEP1在蛋白的中心部分含有4個保守的半胱氨酸殘基(第5、75、94、112位)，猜測PEP1蛋白中間部分的4個半胱氨酸可能通過參與二硫橋的形成來影響PEP1的功能。親水性/疏水性分析發(fā)現(xiàn)，整條肽鏈的親水性氨基酸數(shù)量多于疏水性氨基酸數(shù)量(圖3)，推測PEP1是親水性蛋白。利用Psipred在線工具對PEP1進行了二級結(jié)構(gòu)預測，無規(guī)則卷曲比例為64.61%，α螺旋和β折疊分別為20.22%和15.17%，如圖4所示；利用swiss–model預測其三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖5所示。模型中顯示2個雙鏈反平行的β–sheets，與纖維連接蛋白糖基化第二型模塊相似[10]，推測可能與蛋白糖基化相關(guān)。

圖2 玉米瘤黑粉菌SG200 PEP1信號肽分析結(jié)果

圖3 玉米瘤黑粉菌SG200 PEP1疏水性分析結(jié)果

圖4 玉米瘤黑粉菌SG200 PEP1二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果

圖5　玉米瘤黑粉菌SG200 PEP1三級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果

2.3　pET–28a–pep1原核表達載體的構(gòu)建

將基因片段與載體pET–28a用相同的HⅠ和d Ⅲ內(nèi)切酶雙酶切后，連接轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α，挑取單菌落，用載體測序引物進行PCR鑒定，大小符合預期之后，交由生物公司測序，測序結(jié)果與GenBank中玉米瘤黑粉菌DNA序列(Accession No.Um01987 )結(jié)果完全一致。選取測序結(jié)果正確的重組菌株，提取質(zhì)粒，進行HⅠ和d Ⅲ內(nèi)切酶雙酶切鑒定，鑒定結(jié)果(圖6)符合預期，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。將構(gòu)建成功的pET–28a–轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌BL21(DE3)中，通過抗性平板篩選與PCR鑒定，成功構(gòu)建了原核表達系統(tǒng)。

M為DNA分子量大小標記；泳道1為重組質(zhì)粒pET–28a– pep1Bam HⅠ、Hind Ⅲ雙酶切結(jié)果；泳道2為質(zhì)粒pET–28a Bam HⅠ、Hind Ⅲ雙酶切結(jié)果。

2.4　pep1基因的誘導表達及純化

通過ProtParam在線工具預測插入載體后組氨酸標簽融合蛋白大小為20 800。以BL21(DE3)菌株和重組菌株pET–28a/BL21為陰性對照，重組菌株pET–28a–/BL21為陽性對照誘導表達。利用化學滲透法破碎細胞，進行SDS–PAGE檢測，發(fā)現(xiàn)重組表達質(zhì)粒pET–28a–在15 000～25 000有明顯的表達帶，與預測的融合蛋白大小(20 800)大小相符，如圖7所示，說明重組表達質(zhì)粒pET–28a–能夠在BL21(DE3)中表達。

M示DNA分子量大小標記；泳道1為誘導后大腸埃希菌BL21(DE3)；泳道2為誘導后重組菌株pET–28a/BL21；泳道3為誘導后重組菌株pET–28a–1E08/BL21(陽性對照)；泳道4為誘導后重組菌株 pET–28a–pep1/BL21。

3　結(jié)論與討論

玉米瘤黑粉菌在玉米上的寄生過程可人為地分為7個步驟：1)形成致病性雙核菌絲體；2)附著于植物表面；3)穿透寄主表皮；4)消減寄主防御反應；5)寄主體內(nèi)菌絲增殖；6)使寄主瘤變；7)生成雙倍體冬孢子[11]?；騾⑴c了其中穿透寄主表皮和消減寄主防御反應2個過程?；虻娜笔Э娠@著降低病菌侵染率，減輕玉米病害[12–14]。鑒于基因的重要生物學作用，理論上PEP1效應子可作為防控玉米瘤黑粉病的關(guān)鍵靶標。

本試驗通過構(gòu)建原核表達載體pET–28a–后，在大腸埃希菌BL21(DE3)中誘導表達，方法如下：將重組菌株單菌落置于含有卡那霉素的1 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床，225 r/min培養(yǎng)4 h之后，取上述菌液1 mL接種于10 mL 含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床，225 r/min培養(yǎng)至菌液濃度600達0.6，再加入10 μL 1 mol/L IPTG，使培養(yǎng)基中IPTG的終濃度為1mmol/L，混勻后置于30 ℃搖床中，180 r/min培養(yǎng)，誘導3 h。利用化學方法破碎細胞之后進行SDS–PAGE檢測，得到PEP1的特異條帶，大小(20 800)符合預期，表明能夠利用原核表達實現(xiàn)對玉米瘤黑粉菌PEP1蛋白的高效表達。

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Expression and bioinformatics analysis of effector protein PEP1 fromSG200

LIU Yunyun, LI Zhimin, CHENG Yi, YU Yongting, CHEN Jia, YAN Zhun*

(Institute of Bast Fiber Crops, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Changsha, Hunan 410205, China)

PEP1 protein is one of the effector proteins of the. The study of PEP1 protein plays an important role for the new method development to combat the corn smut. In this study, the structure ofgene was expressed, the resulting proteins were purified and analyzed by bioinformatics method. The recombinant expression plasmid pET-28a-was constructed, andBL21 (DE3) was used as a host strain and induced with 1 mmol/L IPTG. The results of SDS-PAGE showed that the size of the induced expression product PEP1 was consistent with the theoretical value (20 800), indicating that pET-28a-is a capable strain to highly express the target protein inBL21 (DE3).

; SG200 strain; effector protein PEP1; bioinformatics analysis

10.13331/j.cnki.jhau.2020.01.005

Q786

A

1007-1032(2020)01-0028-05

2018–11–19

2019–02–15

湖南省重點研發(fā)計劃項目(2016WK2030)；中國農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程項目(CAAS–ASTIP–2015–IBFC09)

劉云云(1993—)，女，河南信陽人，碩士研究生，主要從事微生物分子生物學與基因工程研究，m18503765307@163.com；

，嚴準，研究員，主要從事病原菌納米抗體研發(fā)及其病害診斷和防治研究，yanzhuntoronto@gmail.com

劉云云，李智敏，程毅，余永廷，陳佳，嚴準．玉米瘤黑粉菌SG200效應蛋白PEP1表達及生物信息學分析[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學學報(自然科學版)，2020，46(1)：28–32．

LIU Y Y, LI Z M, CHENG Y, YU Y T, CHEN J, YAN Z. Expression and bioinformatics analysis of effector protein PEP1 fromSG200[J]．Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences), 2020, 46(1): 28–32.

http://xb.hunau.edu.cn

責任編輯：毛友純

英文編輯：柳正