應(yīng) 勇 柳慧金

腦外傷是一種由各種外力導(dǎo)致腦組織損傷的疾病。中藥在治療腦卒中及神經(jīng)退行性疾病中占有重要地位。研究表明，丹酚酸B 或總丹酚酸A 可以改善腦缺血再灌注損傷小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙情況，對(duì)神經(jīng)組織損傷有保護(hù)作用[1-2]。白藜蘆醇[3]、姜黃素[4]等中藥成分通過(guò)調(diào)節(jié)沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulatorprotein，SIRT1）-叉頭框蛋白O1（fork-head box O1，F(xiàn)oxO1）-自噬通路改善腦缺血損傷狀況。本研究以SD 大鼠為對(duì)象制備腦外傷模型，向其腹腔注射丹參提取物（Salvia Miltiorr-hiza Extract，SME）或SIRT1 抑制劑（selisistat，EX-527）進(jìn)行交叉實(shí)驗(yàn)，通過(guò)觀察大鼠腦神經(jīng)元損傷情況及SIRT1、FoxO1 的mRNA 和蛋白表達(dá)的影響，探討SME 影響SIRT1-FoxO1-自噬通路改善大鼠腦外傷的可能機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng) 物 SPF 清潔級(jí)SD 大鼠78 只，雌雄各半，購(gòu)自東南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2017-0003，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（蘇）2017-0041，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：20180114，10 周齡，體質(zhì)量為（220±20）g，12h/12h（白光/紅光）下飼養(yǎng)，溫度為（24±2）℃，相對(duì)濕度范圍為37%～46%，自由飲食、飲水，定期更換墊料、飼料，經(jīng)常清理、更換鼠箱，保持環(huán)境清潔、安靜、通風(fēng)良好。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)浙江省臺(tái)州市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審核，批文號(hào)：（倫審）2018-0004 號(hào)。

1.2 藥物制備 丹參來(lái)自我院中藥房（采購(gòu)自亳州市譙城區(qū)眾營(yíng)種植專業(yè)合作社），經(jīng)藥劑科梁震野副主任藥師鑒定后為正品。丹參藥材粉碎呈粗粉后，加入75%乙醇加熱回流提取5 次，定量濾紙過(guò)濾，合并濾液后常壓蒸餾濃縮獲得濃膏，再將濃膏在烘箱中90℃干燥，粉碎后獲得SME。高效液相色譜測(cè)定所得SME 中丹參素平均含量為0.63mg/g。

1.3 主要試劑及儀器 超特敏電化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒、尼氏焦油紫染液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)P0018AS、C0117）；兔抗SIRT1 多克隆抗體（美國(guó)圣克魯斯生物技術(shù)，批號(hào)sc-15404）；兔抗Fox-O1 多克隆抗體（德國(guó)默克生命科學(xué)有限公司，批號(hào)SAB3500507）；兔抗β-actin 多克隆抗體、HRP 標(biāo)記羊抗兔IgG（英國(guó)abcam 公司，批號(hào)ab1801、ab5851）；DAB 顯色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)DA1010）；TRIzol 試劑盒（賽默飛世爾科技有限公司，批號(hào)15596018）；cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（天根生化科技有限公司，批號(hào)KR202）；ECL 顯色試劑盒（上海翊圣生物科技有限公司，批號(hào)36208ES60）；冰凍切片機(jī)（德國(guó)徠卡公司，型號(hào)：CM1950）；倒置熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司，型號(hào)：IX73）；RT-PCR儀（瑞士羅氏公司，型號(hào)：LightCycler 96）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組 將SD 大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、SME 低、中、高劑量組和抑制劑組，每組13 只。

2.2 建模及給藥 參照改良Feeney 法[5]進(jìn)行建模，使用自制的自由落體打擊器進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。打擊器下方為大鼠頭部固定裝置，大鼠端腦正上方懸置金屬套管，套管上端固定打擊物，設(shè)置固定高度為30cm。向腹腔注射2%戊巴比妥鈉（40mg/kg）對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉。完全麻醉后通過(guò)咬桿和耳桿將大鼠頭部固定在自制打擊器平臺(tái)上，剪去頭皮，用顱骨鉆打開(kāi)右側(cè)顱骨，用2 號(hào)針頭挑出硬腦膜，不挑開(kāi)軟腦膜。充分暴露腦組織，使用套管下端靠近暴露的腦組織，釋放的打擊物通過(guò)套管到達(dá)大鼠端腦軟組織，從而導(dǎo)致右側(cè)大腦半球局部腦挫裂傷。假手術(shù)組僅開(kāi)天窗不實(shí)施打擊。動(dòng)物造模成功后，假手術(shù)組和模型組大鼠腹腔注射生理鹽水2mL；SME 低、中、高劑量組大鼠分別腹腔注射0.75、1.50、3.00mg/kg 的SME；抑制劑組先按照1.50mg/kg 的SME 溶液給藥，隨后以5mg/kg劑量腹腔注射EX-527[6]；各組注射體積均為2mL。每周稱重1 次，根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整藥量，每周注射1 次，注射持續(xù)4 周后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 冰凍切片及尼氏染色 每組各取3 只大鼠，對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，進(jìn)行心臟灌流。先灌入PBS，待右心耳流出清澈液體后開(kāi)始灌入300mL 冰浴過(guò)的4%多聚甲醛，取大鼠腦投入4%多聚甲醛后4℃過(guò)夜，冠狀切成小段，然后在20%、30%蔗糖溶液中梯度脫水。脫水完成后進(jìn)行冠狀面冰凍切片，切片厚度30μm。按照說(shuō)明書步驟進(jìn)行尼氏染色。經(jīng)過(guò)脫水、封片、晾干步驟后，使用切片全景掃描系統(tǒng)獲取染色后的切片圖像（由武漢賽維爾生物科技有限公司提供）。

2.4 免疫組化檢測(cè)大鼠腦組織SIRT1 和FoxO1 陽(yáng)性細(xì)胞比例 取冰凍切片，將切片放入枸櫞酸鈉緩沖液（0.1mmol/L，pH=6.0）中。胎牛血清封閉，加一抗4℃過(guò)夜（一抗稀釋比例均為1:500），加二抗37℃孵育1h 后，用DAB 試劑盒顯色，顯色過(guò)程中注意控制本底水平。沖洗掉DAB 殘留后用蘇木素再次復(fù)染、組織脫水透明、封片。SIRT1、FoxO1 陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)：每個(gè)對(duì)象單個(gè)指標(biāo)選4 張切片，單張切片再隨機(jī)選擇5 個(gè)不重疊視野（×400）進(jìn)行拍照。

2.5 RT-PCR 檢測(cè)大鼠腦組織SIRT1 和FoxO1 mRNA 表達(dá)量 每組各取4 只大鼠，取右側(cè)腦組織剪碎，加入液氮進(jìn)行組織研磨，4℃下分別加入TRIzol、氯仿、異丙醇、無(wú)RNA 酶水（0.1%焦碳酸二乙酯溶液）后以8000g 離心力離心10min 制備出總RNA，紫外分光光度計(jì)分析RNA 純度和含量合格后，然后置于EP 管中反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。取cDNA 作為定量模板，經(jīng)歷熱循環(huán)，擴(kuò)增后收集熒光信號(hào)，采用相對(duì)量化研究分析數(shù)值，計(jì)算方法為2-ΔΔct。所用引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，見(jiàn)表1。

2.6 Western blot 檢測(cè)大鼠腦組織SIRT1 和FoxO1蛋白表達(dá) 每組取6 只大鼠用于實(shí)驗(yàn)，將大鼠腦組織剪碎放入PE 管，加入陶瓷研磨珠和預(yù)冷的蛋白提取液放入研磨機(jī)中低溫研磨。研磨后離心取上清液，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)總蛋白含量，再調(diào)整蛋白濃度至800μg/mL。等量加入上樣緩沖液煮沸5min。冷卻至室溫后，4℃下保存?zhèn)溆?。每孔加?0μg 蛋白樣品進(jìn)行凝膠電泳，半干后轉(zhuǎn)至醋酸纖維素膜，室溫封閉1h。加入一抗（稀釋比例1:1000），4℃冰箱孵育過(guò)夜。加入二抗（1:1000），37℃反應(yīng)2h，ECL 顯色后顯影儀曝光拍照。照片使用ImageJ 15.1 進(jìn)行半定量分析。

表1 RT-PCR 引物序列及產(chǎn)物片段

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。各組間比較采用單因素方差（One-Way ANOVA）分析，兩兩比較采用SNK q 檢驗(yàn)法。在免疫組化陽(yáng)性細(xì)胞比例檢測(cè)中，使用3σ 法剔除每個(gè)對(duì)象20 個(gè)觀測(cè)值中的異常值后取均值作為該對(duì)象的計(jì)量值。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 尼氏染色 假手術(shù)組大鼠腦組織神經(jīng)元形態(tài)良好，尼氏小體染色清晰，膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)纖維排布緊密；模型組大鼠腦組織神經(jīng)元變形嚴(yán)重，壞死細(xì)胞被全染，細(xì)胞核分布稀疏，外傷部位出現(xiàn)疏松水腫；SME 低劑量組腦組織有少量的血管充血，神經(jīng)元變形壞死情況較模型組有明顯改善，組織形態(tài)較為完整；SME 中、高劑量組大鼠腦組織神經(jīng)元較低劑量組有一定改善，視野中未出現(xiàn)全染的損傷神經(jīng)元；抑制劑組視野中出現(xiàn)個(gè)別全染損傷神經(jīng)元，但總體神經(jīng)元形態(tài)與SME 低劑量組差別不大，見(jiàn)插頁(yè)圖1。

3.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)大鼠腦組織SIRT1 和FoxO1陽(yáng)性細(xì)胞比例 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織SIRT1 和FoxO1 陽(yáng)性細(xì)胞比例均顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，抑制劑組大鼠腦組織SIRT1 陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著降低（P<0.05），SME 高劑量組大鼠腦組織SIRT1 和FoxO1 陽(yáng)性細(xì)胞比例均顯著升高（P<0.05）；與抑制劑組比較，SME 低劑量組大鼠腦組織FoxO1 及中、高劑量組大鼠腦組織SIRT1 和Fox－O1 陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著升高（P<0.05）；與SME 低劑量組比較，SME 高劑量組大鼠腦組織SIRT1 陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著升高（P<0.05）。見(jiàn)表2、插頁(yè)圖2-3。

圖1 大鼠右側(cè)端腦冰凍切片結(jié)果（尼氏焦油紫染色，40×，n=3）

圖2 大鼠右側(cè)端腦冰凍切片SIRT1 免疫組化染色結(jié)果（400×，n=3）

圖3 大鼠右側(cè)端腦冰凍切片F(xiàn)oxO1 免疫組化染色結(jié)果（n=3，400×）

3.3 RT-PCR 檢測(cè)大鼠腦組織SIRT1 和FoxO1 mRNA 水平變化 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織SIRT1 和FoxO1 mRNA 表達(dá)顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，抑制劑組大鼠腦組織SIRT1mRNA 表達(dá)顯著降低（P<0.05），SME 高劑量組大鼠腦組織SIRT1 和FoxO1 mRNA 表達(dá)顯著升高（P<0.05）；與抑制劑組比較，SME 低、中、高劑量三組大鼠腦組織SIRT1 和FoxO1 mRNA 表達(dá)均升高（P<0.05）；與SME 低劑量組比較，SME 中劑量組大鼠腦組織FoxO1、SME 高劑量組大鼠腦組織SIRT1 和FoxO1 mRNA 表達(dá)顯著升高（P<0.05）；與SME 中劑量組比較，SME 高劑量組大鼠腦組織SIRT1 和Fox－O1 表達(dá)顯著升高（P<0.05）。見(jiàn)表3。

表2 各組大鼠腦組織SIRT1 及FoxO1 染色陽(yáng)性細(xì)胞比例（%，）

表2 各組大鼠腦組織SIRT1 及FoxO1 染色陽(yáng)性細(xì)胞比例（%，）

注：假手術(shù)組和模型組予腹腔注射2mL 生理鹽水；SME 低劑量組予腹腔注射0.75mg/kg SME；SME 中劑量組予腹腔注射1.50mg/kg SME；SME 高劑量組予腹腔注射3.00mg/kg SME；抑制劑組予腹腔注射1.50mg/kg SME+5mg/kg SIRT1 抑制劑；SME 為丹參提取物；SIRT1為沉默信息調(diào)節(jié)因子1；FoxO1 為叉頭框蛋白O1；與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與抑制劑組比較，cP＜0.05；與SME 低劑量組比較，dP＜0.05

表3 各組大鼠腦組織SIRT1 及FoxO1 mRNA 表達(dá)水平變化（）

表3 各組大鼠腦組織SIRT1 及FoxO1 mRNA 表達(dá)水平變化（）

注：假手術(shù)組和模型組予腹腔注射2mL 生理鹽水；SME 低劑量組予腹腔注射0.75mg/kg SME；SME 中劑量組予腹腔注射1.50mg/kg SME；SME 高劑量組予腹腔注射3.00mg/kg SME；抑制劑組予腹腔注射1.50mg/kg SME+5mg/kg SIRT1 抑制劑；SME 為丹參提取物；SIRT1為沉默信息調(diào)節(jié)因子1；FoxO1 為叉頭框蛋白O1；與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與抑制劑組比較，cP＜0.05；與SME 低劑量組比較，dP＜0.05；與SME 中劑量組比較，eP＜0.05

3.4 Western blot 檢測(cè)大鼠腦組織SIRT1 和FoxO1蛋白水平變化 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織SIRT1 和FoxO1 蛋白表達(dá)量顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，抑制劑組大鼠腦組織SIRT1 蛋白表達(dá)量顯著降低（P<0.05），SME 低、中、高劑量三組大鼠腦組織SIRT1 和SME 高劑量組FoxO1 蛋白水平均顯著升高（P<0.05）；與抑制劑組比較，SME 低劑量組大鼠腦組織SIRT1 及SME 中、高劑量?jī)山MSIRT1和FoxO1 蛋白水平都顯著升高（P<0.05）；與SME 低劑量組比較，SME 中、高劑量?jī)山M大鼠腦組織的SIRT1 和SME 高劑量組FoxO1 蛋白水平顯著升高（P<0.05）。見(jiàn)表4、插頁(yè)圖4。

圖4 各組大鼠STIR1 及FoxO1 Weston blot 結(jié)果

表4 各組大鼠腦組織STIR1 及FoxO1 蛋白表達(dá)相對(duì)強(qiáng)度值比較（）

表4 各組大鼠腦組織STIR1 及FoxO1 蛋白表達(dá)相對(duì)強(qiáng)度值比較（）

注：假手術(shù)組和模型組予腹腔注射2mL 生理鹽水；SME 低劑量組予腹腔注射0.75mg/kg SME；SME 中劑量組予腹腔注射1.50mg/kg SME；SME 高劑量組予腹腔注射3.00mg/kg SME；抑制劑組予腹腔注射1.50mg/kg SME+5mg/kg SIRT1 抑制劑；SME 為丹參提取物；SIRT1為沉默信息調(diào)節(jié)因子1；FoxO1 為叉頭框蛋白O1；與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與抑制劑組比較，cP＜0.05；與SME 低劑量組比較，dP＜0.05

4 討論

自噬是細(xì)胞內(nèi)重要的分解代謝過(guò)程，是機(jī)體在應(yīng)對(duì)不良刺激如外傷、缺血、缺氧等應(yīng)激狀態(tài)下啟動(dòng)的一種自我保護(hù)機(jī)制，是細(xì)胞清除受損細(xì)胞器的主要途徑。自噬在細(xì)胞中具有維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和結(jié)構(gòu)重塑的重要作用[7]。腦組織受到機(jī)械、缺血、缺氧等損傷時(shí)，大量神經(jīng)元的正常自噬，能夠促進(jìn)神經(jīng)元受損后的存活[8]。因此，自噬在各種腦缺血、腦損傷發(fā)生及預(yù)后中具有重要作用。SIRT1 屬于煙酰腺嘌呤二核苷酸依賴的類組蛋白去乙酰化酶，廣泛存在于各組織細(xì)胞中。FoxO（叉頭轉(zhuǎn)錄因子）是一類關(guān)鍵的調(diào)控因子，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和DNA 修復(fù)[9]。FoxO 還能夠激活細(xì)胞的自噬活性，在分子水平上參與細(xì)胞的增殖分化等過(guò)程，其中又以FoxO1、FoxO3 的作用最為廣泛[10]。FoxO1 蛋白活性受乙?；?、磷酸化和泛素化調(diào)節(jié)，其基因的轉(zhuǎn)錄激活也會(huì)受到SIRT1 等上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的乙?；?去乙?；{(diào)節(jié)。SIRT1 調(diào)節(jié)自噬是一個(gè)比較復(fù)雜的過(guò)程。目前研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1 調(diào)節(jié)自噬的途徑主要有兩種：一是通過(guò)去乙?；允上嚓P(guān)基因的表達(dá)產(chǎn)物來(lái)直接影響自噬；二是位于細(xì)胞核內(nèi)的SIRT1 通過(guò)激活FoxO1 基因誘導(dǎo)自噬[11]。也有研究表示，SIRT1 也能通過(guò)調(diào)控線粒體途徑的自噬激活，維持神經(jīng)元功能穩(wěn)定[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠腦組織形態(tài)和神經(jīng)元損傷程度比假手術(shù)組嚴(yán)重；SIRT1 和FoxO1 陽(yáng)性細(xì)胞比例、mRNA 和蛋白表達(dá)量均顯著高于假手術(shù)組（P<0.05）。Kou 等[13]研究指出，這種SIRT1 和FoxO1 升高現(xiàn)象可能是造模后大鼠腦外傷部位的缺血和營(yíng)養(yǎng)剝奪激活了SIRT1-FoxO1-自噬通路，從而調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞自噬以保護(hù)神經(jīng)功能。

丹參是臨床常用中藥，用于治療瘀血諸癥、瘡癰腫毒熱病、煩躁神昏以及心悸失眠等。SME 有減輕內(nèi)皮損傷、抗炎、抗血小板聚集、調(diào)節(jié)糖脂代謝的作用[14]。其中丹參水溶性成分有很強(qiáng)的抗脂質(zhì)過(guò)氧化和抗自由基能力[15]。而丹參酮IIA 等脂溶性成分則可以通過(guò)降低炎性因子水平來(lái)降低血壓和改善心臟功能[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SME 處理組大鼠的腦組織形態(tài)和神經(jīng)元損傷程度都比模型組有顯著改善；SME 中、高劑量?jī)山M大鼠腦組織SIRT1 和FoxO1 的陽(yáng)性細(xì)胞比例、mRNA 和蛋白表達(dá)量相比模型組都有不同程度升高（P<0.05），并且跟劑量呈正相關(guān)（P<0.05）；可見(jiàn)其促進(jìn)SIRT1 升高的效果同姜黃素和白藜蘆醇的作用效果類似；雖然FoxO1 也可以通過(guò)p-AKT/FoxO1等其他通路進(jìn)行調(diào)節(jié)，結(jié)果顯示SIRT1 和FoxO1 隨劑量變化趨勢(shì)相同，這說(shuō)明FoxO1 在大鼠腦組織中的表達(dá)受到SIRT1 的正向調(diào)控[17]。抑制劑組丹參注射液給藥量與SME 中劑量組是相同的，但EX527 能抑制SIRT1 的去乙?；饔?。在抑制劑作用下抑制劑組的SIRT1 的mRNA 和蛋白水平顯著低于模型組或SME 中劑量組（P<0.05），但FoxO1 的mRNA 和蛋白水平卻與模型組和SME 中劑量組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。據(jù)此推測(cè)SME 不僅能夠促進(jìn)SIRT1 的表達(dá)量升高，還能夠增強(qiáng)SIRT1 的去乙?；钚?，從而使FoxO1 在mRNA 和蛋白表達(dá)量升高。在氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等病理情況下，組織細(xì)胞常出現(xiàn)自噬活動(dòng)的過(guò)度激活，而過(guò)度的自噬會(huì)引起細(xì)胞無(wú)法存活[18]。神經(jīng)元自噬的發(fā)生與尼氏小體有關(guān)，在尼氏染色結(jié)果中我們還注意到，處理組切片的神經(jīng)元尼氏小體的密度整體好于模型組[19]。這說(shuō)明SME 能夠有效保護(hù)處理組的神經(jīng)元形態(tài)，使其不過(guò)度自噬。

綜上所述，丹參注射液后處理能夠促進(jìn)腦外傷大鼠SIRT1 表達(dá)，增強(qiáng)SIRT1 的去乙?；钚?，正向調(diào)節(jié)SIRT1-FoxO1-自噬通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。