任凌燕 朱 鳴 朱華艷 丁 敏 費丹峰 霍麗霞 王霄一

糖尿病能夠誘發(fā)足細(xì)胞損傷，使足細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞連接間隙發(fā)生改變，最終導(dǎo)致蛋白尿和糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）形成[1]。因此，DN 在一定意義上被認(rèn)為是一種“足細(xì)胞疾病”。雷公藤甲素能夠減輕DN 足細(xì)胞損傷，改善腎小球濾過膜通透性，降低尿蛋白，改善血漿白蛋白水平，起到保護(hù)患者腎功能的作用[2]。Toll-樣受體4（TLR4）和核因子κB（NF-κB）作為炎癥反應(yīng)脅迫的重要調(diào)節(jié)劑，其表達(dá)水平的升級或過度激活可能是導(dǎo)致糖尿病腎臟損傷的重要機(jī)制之一[3]。本實驗應(yīng)用9 周齡db/db 小鼠為研究對象，以TLR/NF-κB 信號通路和足細(xì)胞損傷為重要切入點，觀察雷公藤甲素治療DN 的療效，探索其防治DN 的作用機(jī)制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 9 周齡健康雄性BKS-db/db 小鼠18 只，體質(zhì)量（38.25±1.42）g，9 周齡BKS-db/m 對照小鼠6 只，體質(zhì)量（20.10±1.50）g，均購于南京大學(xué)模式動物研究所，實驗動物許可證號：SYXK（蘇）2015-0001，動物倫理批件號：IACUC-20190729-09，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，溫度24～28℃，濕度75%左右，適應(yīng)SPF 環(huán)境1 周，自由攝食基礎(chǔ)飼料。

1.2 藥物與試劑 雷公藤甲素（批號ST8290）購自北京索萊寶科技有限公司，高效液相色譜測試表明，藥物純度在99%以上，用少量二甲基亞砜將藥物完全溶解，然后用生理鹽水配制相應(yīng)濃度（5μg/mL）。替米沙坦（批號ST9190）購自北京索萊寶科技有限公司，用生理鹽水配制相應(yīng)濃度（0.5mg/mL）。小鼠尿微量白蛋白酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測試劑盒（批號E038）、血清白蛋白（批號A028-1）、血糖（批號BC1875）、血清肌酐（批號BC1875）、血清總膽固醇（批號A111-1）、血清三酰甘油（批號F001）均購自南京建成生物科技有限公司。Nephrin 抗體（批號ab216341）、Podocin 抗體（批號ab50339）、TLR4 抗體（批 號ab13556）和NF-κB（p65）抗 體（批 號ab246347）均購自英國Abcam 公司。通用免疫組化染色試劑盒（批號ZLI908）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。總蛋白提取試劑盒（批號WB-0072）、BCA蛋白定量試劑盒（批號BCA02）、內(nèi)參GAPDH（批號GA-003R）、蛋白Marker（批號PM-0011）、聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（批號WB-0131）均購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司。

2 實驗方法

2.1 實驗分組 9 周齡BKS-db/m 小鼠6 只為正常對照組，18 只9 周齡BKS-db/db 小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為DN 對照組、替米沙坦組及雷公藤甲素組，各6 只。各組小鼠自由進(jìn)食、進(jìn)水，保持墊料干燥，12h明暗交替照明。

2.2 給 藥 替米沙坦組予替米沙坦懸液（5mg/kg）灌胃，1 天1 次；雷公藤甲素組予雷公藤甲素懸液（50μg/kg）灌胃，1 天1 次；正常對照組和DN 對照組給予等量0.9%生理鹽水灌胃，1 天1 次，持續(xù)給藥8 周。

2.3 24h 尿蛋白定量檢測 給藥后第8 周，使用小鼠代謝籠收集各組小鼠24h 尿液并記錄尿量，低速低溫離心機(jī)（SIGMA，德國）中2500r/min×3min 離心，離心半徑13.5cm，去除沉渣。按試劑盒檢測說明采用ELISA 法進(jìn)行尿白蛋白測定。

2.4 血生化指標(biāo)檢測及腎組織取材 給藥后第8周，小鼠處理前稱重，心臟取血，分離血漿，-20℃保存，使用HITACHI7080 全自動生化分析儀進(jìn)行血清白蛋白、血糖、肌酐、總膽固醇、三酰甘油測定。剝離雙側(cè)腎臟，用濾紙吸干雙腎表面血液后稱重，計算腎臟指數(shù)[腎臟指數(shù)=左腎質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）×100%]。右腎1/2 保存于福爾馬林溶液中用于石蠟包埋，剩余右腎1/2 與左腎液氮冷凍后保存于-80℃冰箱用于蛋白印跡法（Western blot）檢測。

2.5 免疫組化法（IHC）檢測小鼠腎臟WT1 蛋白表達(dá)并計數(shù)足細(xì)胞數(shù)量 取各組小鼠左側(cè)腎臟石蠟切片標(biāo)本脫蠟、脫水，抗原暴露，先后滴加一抗（WT1 1:200），二抗（1:5000），DAB 顯色后脫水、透明，中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠腎臟WT1 表達(dá)并取圖。采用disector/fractionator 方法計數(shù)各組小鼠的足細(xì)胞數(shù)量[4]。

2.6 Western blot 檢測小鼠腎組織Nephrin、Podocin、TLR4 及NF-κB 表達(dá) 稱取各組小鼠左腎臟組織50mg 于4mL 離心管中，加入細(xì)胞裂解液、蛋白酶抑制劑等使之充分混合后，冰浴20min，低溫離心5min，收集上清液，加入蛋白上樣緩沖液，煮沸變性，聚丙烯酰胺凝膠電泳。將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，脫脂奶粉封閉并行一抗Nephrin（稀釋度1:500）、Podocin（稀釋度1:2000）、TLR4（稀釋度1:500）、NF-κB（稀釋度1:1000）、GAPDH（稀釋度1:10000）進(jìn)行孵育，在4℃過夜，用Tris 緩沖鹽溶液洗滌膜，加入第二抗體（稀釋度1:2000）孵育并洗滌膜。用高靈敏度化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）研制該膜，并用凝膠成像分析系統(tǒng)對該帶進(jìn)行分析。以GAPDH 為內(nèi)參照，獲得目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)。

2.7 腎臟組織病理學(xué)改變 將取好的各組小鼠右腎1/2 組織用體積分?jǐn)?shù)10%的甲醛溶液固定腎組織，常規(guī)石蠟包埋，2μm 厚切片，行過碘酸雪夫反應(yīng)染色（PAS），觀察腎臟組織病理學(xué)變化情況。

2.8 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件，計量資料均進(jìn)行正態(tài)分布和方差齊性檢驗，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，方差齊性時多組間比較采用單因素方差分析；方差不齊性時采用Brown-Forsythe 分析。非正態(tài)分布的計量資料采用Kruskal-Wallis H 檢驗。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠一般情況比較 與正常對照組比較，DN 對照組、替米沙坦組及雷公藤甲素組小鼠逐漸出現(xiàn)精神萎靡、毛色不順滑、多飲、多食、多尿以及消瘦等癥狀，且DN 對照組小鼠癥狀更典型。

3.2 各組小鼠24h 尿蛋白定量、體質(zhì)量及腎臟指數(shù)變化 實驗第8 周，DN 對照組小鼠24h 尿蛋白定量較正常對照組明顯增加（P＜0.01），替米沙坦組和雷公藤甲素組較DN 對照組24h 尿蛋白定量明顯下降（P 均＜0.01），替米沙坦組與雷公藤甲素組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。肉眼可見DN 對照組、替米沙坦組、雷公藤甲素組小鼠腎臟體積明顯增大，質(zhì)地柔軟，腎臟周圍有大量脂肪包繞，剖面皮質(zhì)腫脹且蒼白，髓質(zhì)呈現(xiàn)暗紅色。DN 對照組小鼠體質(zhì)量、腎臟指數(shù)較正常對照組小鼠明顯增加（P 均＜0.01），替米沙坦組、雷公藤甲素組較DN 對照組腎臟指數(shù)明顯下降（P 均＜0.01），見表1。

表1 各組小鼠24h 尿蛋白定量、體質(zhì)量及腎臟指數(shù)比較（）

表1 各組小鼠24h 尿蛋白定量、體質(zhì)量及腎臟指數(shù)比較（）

注：正常對照組及DN 對照組予等量0.9%生理鹽水灌胃；替米沙坦組予替米沙坦懸液5mg·kg-1·d-1 灌胃；雷公藤甲素組予雷公藤甲素懸液50μg·kg-1·d-1 灌胃；DN 為糖尿病腎病；與正常對照組比較，aP＜0.01；與DN 對照組比較，bP＜0.01

3.3 各組小鼠血生化指標(biāo)比較 實驗第8 周，與正常對照組比較，DN 對照組小鼠血糖、血清肌酐、總膽固醇及三酰甘油水平明顯升高（P 均＜0.01），血清白蛋白明顯下降（P＜0.01）。與DN 對照組比較，雷公藤甲素組血清肌酐、總膽固醇及三酰甘油水平明顯下降（P 均＜0.01），血清白蛋白水平明顯升高（P＜0.01），但雷公藤甲素組與替米沙坦組療效基本相當(dāng)（P 均＞0.05）。雷公藤甲素組、替米沙坦組小鼠血糖水平與DN 對照組小鼠比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P 均＞0.05），見表2。

表2 各組小鼠血生化指標(biāo)比較（）

表2 各組小鼠血生化指標(biāo)比較（）

注：正常對照組及DN 對照組予等量0.9%生理鹽水灌胃；替米沙坦組予替米沙坦懸液5mg·kg-1·d-1 灌胃；雷公藤甲素組予雷公藤甲素懸液50μg·kg-1·d-1 灌胃；DN 為糖尿病腎??；與正常對照組比較，aP＜0.01；與DN 對照組比較，bP＜0.01

3.4 各組小鼠腎臟病理改變 DN 對照組小鼠腎小球體積明顯增大，細(xì)胞數(shù)量增加，系膜基質(zhì)擴(kuò)張，毛細(xì)血管壁增厚以及足細(xì)胞增生和肥大。替米沙坦組和雷公藤甲素組，腎小球體積較DN 對照組小鼠明顯縮?。ㄒ姴屙搱D1）。DN 對照組小鼠足細(xì)胞計數(shù)較正常對照組小鼠明顯下降（P＜0.01），替米沙坦組和雷公藤甲素組足細(xì)胞數(shù)量較DN 對照組明顯上升（P＜0.01），雷公藤甲素組優(yōu)于替米沙坦組（P＜0.05），見表3。

圖1 各組小鼠腎臟病理改變（PAS×400，IHC×400）

表3 各組小鼠足細(xì)胞計數(shù)比較（個/腎小球，）

表3 各組小鼠足細(xì)胞計數(shù)比較（個/腎小球，）

注：正常對照組及DN 對照組予等量0.9%生理鹽水灌胃；替米沙坦組予替米沙坦懸液5mg·kg-1·d-1 灌胃；雷公藤甲素組予雷公藤甲素懸液50μg·kg-1·d-1 灌胃；DN 為糖尿病腎??；與正常對照組比較，aP＜0.01；與DN 對照組比較，bP＜0.01；與替米沙坦組比較，cP＜0.05

3.5 各組小鼠腎組織Nephrin、Podocin、TLR4、NFκB 蛋白表達(dá)比較 實驗第8 周，DN 對照組小鼠足細(xì)胞相關(guān)分子Nephrin、Podocin 蛋白表達(dá)量較正常對照組明顯下降（P 均＜0.01），替米沙坦組與雷公藤甲素組較DN 對照組明顯上升（P 均＜0.01），且雷公藤甲素組優(yōu)于替米沙坦組（P 均＜0.05）。DN 對照組小鼠TLR4、NF-κB 蛋白表達(dá)量較正常對照組明顯上升（P 均＜0.01），替米沙坦組與雷公藤甲素組較DN 對照組明顯下降（P 均＜0.01），替米沙坦與雷公藤甲素療效無差別（P 均＞0.05），見表4、圖1。

表4 各組小鼠腎組織Nephrin、Podocin、TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)量比較（）

表4 各組小鼠腎組織Nephrin、Podocin、TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)量比較（）

注：正常對照組及DN 對照組予等量0.9%生理鹽水灌胃；替米沙坦組予替米沙坦懸液5mg·kg-1·d-1 灌胃；雷公藤甲素組予雷公藤甲素懸液50μg·kg-1·d-1 灌胃；DN 為糖尿病腎??；Nephrin 為腎病蛋白；Podocin為足突蛋白；TLR4 為Toll-樣受體4；NF-κB 為核因子κB；與正常對照組比較，aP＜0.01；與DN 對照組比較，bP＜0.01；與替米沙坦組比較，cP＜0.05

圖1 各組小鼠腎組織Nephrin、Podocin、TLR4、NF-κB 的Western blot 結(jié)果

4 討論

DN 是終末期腎臟疾病最常見的微血管并發(fā)癥，15%～25%I 型糖尿病患者和30%～40%II 型糖尿病患者均會受到影響[5]。研究證實，炎癥和免疫因素是DN的重要發(fā)病機(jī)制之一[6]。足細(xì)胞損傷在DN 發(fā)病機(jī)制中扮演重要角色，DN 早期就伴隨有足細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的變化以及數(shù)量的減少[7-8]。

雷公藤甲素的抗炎與免疫抑制作用早已得到證實[9]。雷公藤甲素能夠上調(diào)足細(xì)胞重要分子Nephrin、Podocin 的表達(dá)及調(diào)整其分布，減輕足細(xì)胞損傷，降低蛋白尿[10]。本實驗結(jié)果顯示，雷公藤甲素可以顯著降低DN 模型小鼠蛋白尿，其效果與替米沙坦片基本相同（P＞0.05）。既往研究表明，高脂血癥對腎臟系膜細(xì)胞、足細(xì)胞有毒害作用[11]。本實驗發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素能夠升高DN 模型小鼠血白蛋白，降低其肌酐、總膽固醇及三酰甘油水平（P 均＜0.01），說明雷公藤甲素能夠改善脂質(zhì)代謝紊亂，保護(hù)腎功能。DN 模型小鼠足細(xì)胞重要分子Nephrin、Podocin 蛋白水平以及足細(xì)胞數(shù)量明顯下降（P 均＜0.01），雷公藤甲素能夠明顯提高Nephrin、Podocin 蛋白水平以及降低足細(xì)胞數(shù)量（P 均＜0.01）。以上結(jié)果進(jìn)一步證明，雷公藤甲素可能通過保護(hù)腎臟足細(xì)胞使蛋白尿、脂質(zhì)代謝紊亂減輕，進(jìn)而保護(hù)腎功能。

炎癥介質(zhì)在DN 發(fā)生、發(fā)展中起到重要的作用，表現(xiàn)為促炎癥介質(zhì)和趨化因子的增加[6]。現(xiàn)有研究提示，炎性因子介導(dǎo)的信號通路的激活有可能會造成細(xì)胞的損傷，TLR-NF-κB（Toll-like receptors and Nuclear factor-kappaB）信號通路就是其中的一條通路[12]。不同的Toll 樣受體（TLRs）在與相應(yīng)的配體結(jié)合后，活化核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，進(jìn)而導(dǎo)致促炎性細(xì)胞因子和趨化因子增加，最終引起炎癥反應(yīng)[13-14]。據(jù)報道，在所有TLRs 中，TLR4 與急性腎損傷，慢性腎臟病和DN 的發(fā)生關(guān)系最密切[15-16]。NF-κB 的激活促進(jìn)了DN 炎癥反應(yīng)及腎臟纖維化[3]。已經(jīng)證明，TLR4/NFκB 通路的促炎癥作用與糖尿病相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)展有關(guān)[17]。但是足細(xì)胞損傷和耗竭的機(jī)制以及足細(xì)胞是否促進(jìn)DN 腎小球炎癥反應(yīng)尚未明確。實驗證實，暴露于高糖的足細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞會促進(jìn)TLR4的激活，從而導(dǎo)致NF-κB 活化以及隨之而來的炎癥和纖維化反應(yīng)[18]。同時，NF-κB 的活化也能夠明顯促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞進(jìn)一步損傷以及TLR4 的表達(dá)增加[19]。以上證據(jù)表明TLR4/NF-κB 通路參與DN 足細(xì)胞損傷過程。本研究顯示，DN 模型小鼠足細(xì)胞重要分子Nephrin、Podocin 蛋白水平明顯下降（P 均<0.01），TLR4、NF-κB 蛋白表達(dá)量明顯上升（P 均<0.01），經(jīng)雷公藤甲素治療后，Nephrin、Podocin 蛋白表達(dá)量明顯上升（P 均<0.01），TLR4、NF-κB 蛋白表達(dá)量明顯下降（P 均<0.01）。腎臟病理也證實了雷公藤甲素能夠明顯改善DN 腎臟病變情況。本研究無法確定TLR4、NF-κB 在導(dǎo)致DN 足細(xì)胞損傷中占有主導(dǎo)地位，但提示TLR4、NF-κB 在足細(xì)胞損傷中占有重要作用。

綜上所述，雷公藤甲素可能通過抑制TLR4/NFκB 通路減輕炎癥反應(yīng)和足細(xì)胞損傷從而改善DN。