陳紅星 黃楷 劉興州 劉靜 吳曉瑩 王家歡 楊川 嚴勵 任萌

糖尿病下肢血管病變包括下肢動脈病變和慢性下肢靜脈病變。其中慢性下肢靜脈病變在近年受到越來越多的關(guān)注[1]。慢性靜脈病變指靜脈系統(tǒng)出現(xiàn)任何形態(tài)學(xué)和功能異常的一組綜合癥候群，包括毛細血管擴張、網(wǎng)狀靜脈、水腫、脂性硬皮病、皮膚色素沉著、靜脈曲張、靜脈性潰瘍等，其中以慢性下肢靜脈疾病最常見，在全球的患病率達69.94%，其中9.1%的患者有活動性或陳舊性潰瘍[2-3]。近幾年來有研究顯示64%～70.7%的糖尿病患者中存在深靜脈功能不全，其發(fā)生率顯著高于普通人群[4]，而在慢性靜脈功能不全患者中糖尿病的發(fā)病率也顯著高于普通人群（17.8% vs 8.6%）[5]。此外，合并糖尿病的患者慢性靜脈疾病病情通常更嚴重[6]。有研究顯示，糖尿病足患者下肢靜脈壓力增高、靜脈血流動力學(xué)受損，但糖尿病下肢靜脈病變的發(fā)生機制目前尚未明確[7]。

血管平滑肌細胞（SMC）和細胞外基質(zhì)（ECM）在靜脈的生理病理過程中具有重要的作用，它們共同構(gòu)成靜脈壁的中膜，I型膠原（COLⅠ）是這一層的主要成分。SMC根據(jù)局部信號在分化（收縮型）和去分化型（合成型）之間進行轉(zhuǎn)換，在血管發(fā)育、修復(fù)和適應(yīng)過程中至關(guān)重要[8]。而在血管ECM中膠原和彈性蛋白含量最高，構(gòu)成ECM的骨架結(jié)構(gòu)，參與維持靜脈血管的形態(tài)和物理性質(zhì)。通常認為， I型膠原（COLⅠ)使組織具有剛性，而Ⅲ型膠原(COLⅢ)賦予組織伸展性，靜脈壁COLⅠ/COLⅢ比例失調(diào)是慢性靜脈功能不全的主要病理變化之一[3]?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一種催化ECM蛋白降解的中性內(nèi)肽酶，其中MMP2屬于明膠酶，可以消化I型、Ⅱ型和Ⅲ型膠原，基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMPs）是參與控制MMPs在組織中局部活性的特異性抑制劑。MMPs/TIMPs共同維持ECM的穩(wěn)態(tài)[9-10]。

本研究通過建立糖尿病大鼠模型，對其大隱靜脈（SV）進行HE染色、Masson染色，觀察糖尿病靜脈的組織學(xué)改變；通過高糖培養(yǎng)靜脈平滑肌細胞（SMCV)，檢測SMCV的活性，探討高糖對SMCV活性的影響；通過檢測高糖處理后SMCV細胞內(nèi)外COLⅠ、COLⅢ的表達，觀察高糖對SMCV膠原合成分泌的影響；通過進一步檢測細胞內(nèi)COLⅠ、COLⅢ、MMP2/TIMP1轉(zhuǎn)錄水平和MMP2/TIMP1蛋白水平的改變，探討高糖影響SMCV膠原表達的可能機制。

材料與方法

一、材料

（一）實驗動物與細胞

4周齡雄性SD大鼠12只，隨機分為糖尿病組（DM組）6只，正常組（NC組）6只，所有動物由廣東省動物中心提供。大鼠大隱靜脈原代平滑肌細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司，經(jīng)α-SMA免疫熒光鑒定，細胞純度＞90%。

（二）主要試劑

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰酶購自Gibco公司，鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）購自SIGMA公司，HE染液套裝、Masson染液套裝均購自武漢賽維爾生物科技有限公司，Cell Counting Kit-8（CCK-8） 購 自APExBio公 司，RIPA裂 解液購自江蘇碧云天公司，BCA蛋白定量試劑盒、PAGE凝膠制備試劑盒購自雅酶公司，兔抗α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA） （14395-1-AP）抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，熒光（Cy3）標記羊抗兔IgG（BA1032）購自武漢博士德生物工程有限公司，TritonX-100（ST795）、DAPI（C1002）購自江蘇碧云天公司，兔抗TIMP1（ab109125）購自Abcam公司，兔抗MMP2（10373-2-AP）購自Proteintech公司，兔抗COLⅠ（GB13022-2）、兔抗COL Ⅲ（GB11023）、兔抗 β-actin（GB11001）、山羊抗兔二抗（G1213）購自武漢賽維爾生物科技有限公司，大鼠Ⅰ型膠原(COLⅠ)ELISA Kit、大鼠Ⅲ型膠原（COLⅢ）ELISA Kit均購自武漢華美生物（CUSABIO）公司，RNA提取試劑盒購自上海奕杉生物科技有限公司，PrimeScript?RT Master Mix（Perfect Real Time） 試 劑 盒、TB Green?Premix Ex Taq?II均購自TAKARA公司。

二、主要方法

（一）糖尿病動物模型建立

適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，分組后禁食不禁水12 h，DM組大鼠給予65 mg/kg的鏈脲佐菌素（STZ）腹腔注射（STZ溶解在枸櫞酸鹽緩沖液中，使用前配備），NC組大鼠腹腔注射等量生理鹽水，注射一周后分別尾靜脈取血檢測隨機血糖，DM組血糖水平≥16.7 mmol/L視為造模成功。造模成功后，所有大鼠每周檢測一次血糖、體重，保證DM組大鼠血糖穩(wěn)定在16.7 mmol/L以上。

（二）大鼠SV取材

糖尿病大鼠造模成功后第5周（5W）、第6周（6W）分別取DM組和NC組大鼠各3只，4%水合氯醛0.3 mL/100g腹腔注射麻醉大鼠，脫毛，75%酒精消毒后沿左后肢內(nèi)側(cè)中部切開皮膚，可見深紅色大隱靜脈，自隱靜脈裂孔取SV0.5 cm[11]，用無菌PBS水漂洗三次，放于4%多聚甲醛固定備用。

（三）HE染色

將大鼠SV石蠟包埋，切片，常規(guī)HE染色，中性樹膠封固。Nikon NI-U正置成像顯微鏡200倍下觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，并進行圖像采集，以肌層內(nèi)外緣作為血管中膜的內(nèi)外緣（見圖1A），用Image J軟件測量血管壁中膜厚度。

（四）Masson染色

石蠟切片后經(jīng)二甲苯脫蠟至水后根據(jù)Masson染色套裝說明書進行染色，中性樹膠封片，Nikon NI-U正置成像顯微鏡200倍下觀察，采集圖像。膠原纖維呈藍色，肌纖維、纖維素和紅細胞呈紅色。用Image J軟件測量血管壁膠原纖維的分布和含量。

（五）細胞免疫熒光染色

在細胞培養(yǎng)皿中將細胞貼壁成功的載玻片用PBS浸洗3 min×3次；4%多聚甲醛固定15 min，PBS浸 洗3 min×3次；0.5%TritonX-100（PBS配制）室溫通透20 min；PBS浸洗后，山羊血清室溫封閉30 min；α-SMA一抗（1∶100）4℃孵育過夜；PBST浸洗3 min×3次，熒光（Cy3）標記羊抗兔IgG（1∶100）室溫孵育1 h，PBST浸洗后DAPI避光孵育5 min，PBST浸洗5 min×4次，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在倒置熒光顯微鏡（Olympus IX71)下觀察并采集圖像，采用Image J軟件分析染色陽性的細胞比例。

（六）細胞培養(yǎng)及處理

將SMCV細胞分為NC組、DM組分別置于糖濃度4.5 g/L、7.2 g/L含10%胎牛血清的DMEM，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，收集培養(yǎng)72 h的SMCV細胞，加入RIPA裂解液冰上孵育30 min，12 000×g，4℃離心30 min，取上清液按BCA蛋白檢測試劑盒說明書操作，檢測并計算單位細胞蛋白含量，兩組配平后按比例加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，95℃加熱10 min后儲存至-80℃冰箱備用。按照RNA提取試劑盒說明書提取細胞內(nèi)RNA，按照PrimeScript? RT Master Mix 試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA備用。

（七）CCK8檢測細胞活性

取SMCV以3 000個/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，細胞貼壁后分別加入葡萄糖濃度4.5 g/L、5.4 g/L、7.2 g/L、9 g/L含10%胎牛血清的DMEM，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 0、1、2、3、4 d 后每孔分別加入CCK8液10 uL繼續(xù)培養(yǎng)箱孵育2 h（培養(yǎng)2 d后換液一次）后置于酶聯(lián)免疫檢測儀（TECAN Spark10M）中，在450 nm波長處檢測各孔的光密度值（OD值）。各組均設(shè)3個復(fù)孔，重復(fù)實驗3次。

（八）Real-time qPCR檢測mRNA水平

利用SYBR Green法在LightCycler480熒光定量PCR儀（Roche Diagnostics公司）上完成Collagen typeⅠalpha 1 chain（COL1A1）、Collagen typeⅢalpha 1 chain（COL3A1）、TIMP1、MMP2 mRNA 表達的檢測。各基因引物采用NCBI Primer-BLAST設(shè)計（見表1），以β-actin內(nèi)參，所有引物均由廣州天一輝遠基因科技有限公司合成，實驗結(jié)果采用2-CT法進行分析。

（九）Western blot 檢測細胞內(nèi)蛋白水平

按說明書配備10%PAGE凝膠，SDS-PAGE分離蛋白后濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，室溫5%脫脂牛奶封閉1 h，1∶1 000吐溫室溫搖床清洗（10 min/次）3次后，放于一抗稀釋液中4℃搖床孵育過夜（以β-actin作為內(nèi)參），清洗3次，二抗室溫搖床孵育2 h，ECL顯影。一抗稀釋：抗TIMP1抗體（1∶5 000）用5%脫脂牛奶稀釋，抗MMP2抗體（1∶1 000）、抗COLⅠ抗體（1∶500）、抗 COL Ⅲ抗體（1∶500）、抗 β-actin抗體（1∶2 000）以5%BSA稀釋。

表1 RT-qPCR 引物序列

（十）ELISA 檢測細胞上清蛋白水平

收集在糖濃度4.5 g/L（NC組）、7.2 g/L（DM組）含10%胎牛血清的DMEM，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h的SMCV細胞培養(yǎng)上清，4℃ 1 000×g離心20 min后嚴格按照試劑盒說明書檢測細胞上清COLⅠ、COLⅢ蛋白水平。

（十一）統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

（一）糖尿病大鼠模型的建立

糖尿病大鼠STZ腹腔注射一周后，DM組隨機血糖（29.13±1.69）mmol/L，后續(xù)每周檢測血糖均≥16.7 mmol/L，造模成功，NC組大鼠血糖無明顯變化（均＜11.00 mmol/L），DM組大鼠出現(xiàn)明顯糖尿病癥狀（多飲、多食、多尿、體重減輕），NC組大鼠無明顯變化。

（二）糖尿病大鼠SV形態(tài)變化

HE染色發(fā)現(xiàn)，造模5周后兩組大鼠血管形態(tài)無明顯變化，6周后DM組大鼠SV管壁中膜厚度為（8.23±0.67）μm，對 比NC組（12.07±0.71）μm明顯變薄（t=3.943，P=0.017）。DM組管腔面積為（16 527.66±3 379.05）μm2，相對于NC組（7 316.68±983.98） μm2管腔變大（t=-2.617，P=0.059） （見圖1）。

圖1 大鼠大隱靜脈HE染色結(jié)果

Masson染色發(fā)現(xiàn)，造模6周后DM組大鼠SV平滑肌細胞排列紊亂，萎縮與增生并存，其膠原含量為（37.58%±6.40%），低于NC組（53.44%±1.31%） （t=2.429，P=0.072） （見圖2）。

（三）SMCV細胞鑒定結(jié)果

SMCV細胞經(jīng)a-SMA免疫熒光染色后，紅色熒光為a-SMA 陽性，分析顯示陽性細胞率＞90%，即細胞純度＞90%（見圖3）。

（四）高糖培養(yǎng)后SMCV細胞活性改變

CCK8實驗結(jié)果顯示，用不同高糖濃度DMEM培養(yǎng)的SMCV細胞均出現(xiàn)不同程度活性抑制，對比NC組（4.5 g/L），5.4 g/L組及7.2 g/L組SMCV在培養(yǎng)2、3、4 d后均出現(xiàn)明顯的活性降低（P＜0.05)，9 g/L組培養(yǎng)3、4 d后均出現(xiàn)明顯的活性降低（P＜0.001） （見圖4）。

（五）高糖培養(yǎng)后SMCV內(nèi)膠原及MMP2/TIMP1 mRNA表達差異

RT-qPCR結(jié)果顯示培養(yǎng)72 h后DM組與NC組SMCV細胞內(nèi)COL1A1 mRNA表達無明顯差異（P＞0.05），DM組COL3A1 mRNA相對表達量（0.56±0.14）對比NC組（1.08±0.08）明顯降低（t=3.271，P=0.031），TIMP1 mRNA 相對表達量（1.32±0.10）對比NC組（0.96±0.04）明顯升高（t=-3.42，P=0.027）升高，MMP2 mRNA相對表達量（0.65±0.10）對比NC組（1.01±0.08）明顯降低（t=2.88，P=0.045） （見圖5）。

圖2 大鼠大隱靜脈Masson染色結(jié)果

圖3 SMCV a-SMA免疫熒光染色結(jié)果

圖4 高糖處理后SMCV CCK8實驗結(jié)果

（六）高糖培養(yǎng)后SMCV細胞內(nèi)膠原及MMP2/TIMP1蛋白表達水平改變

Western Blot結(jié) 果 顯 示 培 養(yǎng)72 h后DM組SMCV細胞內(nèi)COLⅠ蛋白表達下降，COLⅢ蛋白表達無明顯差異，TIMP1降低，MMP2升高（見圖6）。

（七）高糖培養(yǎng)后SMCV細胞外膠原水平改變

ELISA結(jié)果顯示培養(yǎng)72 h后DM組SMCV細胞上清中COLⅠ表達水平明顯低于NC組水平（4 592.35±523.87 pg/mL vs 7 857.38±797.93 pg/mL，t=3.421，P=0.027）；COLⅢ表達水平低于NC組，但無統(tǒng)計學(xué)差異（2 648.10±413.96 pg/mL vs 3 158.35±653.56 pg/mL，P＞0.05）；COLⅠ/COLⅢ比例明顯低于 NC 組（1.76±0.08 vs 2.59±0.26，t=3.043，P=0.038）（見圖6）。

討 論

圖5 高糖培養(yǎng)72 h后SMCV細胞內(nèi)mRNA檢測結(jié)果（*P＜0.05)

本研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠模型在成模6周后出現(xiàn)SV管壁中膜變薄、管腔增大，并伴隨膠原含量減少。體外實驗發(fā)現(xiàn)，高糖能顯著抑制SMCV細胞活性。高糖刺激后SMCV細胞內(nèi)COLⅠmRNA無明顯變化，COLⅢmRNA表達下降，細胞內(nèi)外COLⅠ蛋白表達均顯著降低，COLⅢ蛋白表達無明顯差異，COLⅠ/COL Ⅲ表達比例下降；同時細胞內(nèi)TIMP1表達下降，MMP2表達升高。我們進一步檢測了細胞內(nèi)MMP2/TIMP1轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)高糖刺激后SMCV內(nèi)TIMP1 mRNA表達升高，MMP2 mRNA表達下降，與蛋白表達趨勢不一致，提示高糖可能是通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方式影響MMP2/TIMP1的表達。

糖尿病是一種慢性炎癥性疾病，隨著糖尿病患病率的逐年增高，糖尿病各種慢性并發(fā)癥的發(fā)病率也逐漸提高。近年來，不斷有研究證據(jù)表明糖尿病與慢性靜脈功能不全關(guān)系密切[4-6]，同時，慢性靜脈功能不全病理過程中的靜脈高壓、血流淤滯、慢性炎癥、毛細血管破壞等也可能在糖尿病足的發(fā)生發(fā)展中起到協(xié)同的作用[12]。此外，糖尿病是公認的冠狀動脈血管重建術(shù)后預(yù)后不良的危險因素，通常具有較高的發(fā)病率和死亡率，而自體大隱靜脈是冠狀動脈旁路移植術(shù)的常用血管移植材料[13-14]。因此，明確糖尿病對下肢靜脈組織形態(tài)及功能的影響，探索其病理變化機制具有重要的臨床意義。

慢性靜脈功能不全的大隱靜脈管壁常表現(xiàn)為不均一性改變，肥厚部位常與平滑肌變少細胞外基質(zhì)變少的變薄萎縮部位交替出現(xiàn)[3]。以往對使用SV進行冠狀動脈搭橋的糖尿病患者研究顯示，在糖尿病患者中大隱靜脈的內(nèi)皮相關(guān)血管舒張功能明顯受損[15]。此外，Ivana LAZICH等研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者的頭靜脈管腔面積顯著增大，內(nèi)、中膜增厚，內(nèi)膜 /中膜比值增高[16]；Chakraborty、 SK 等的研究發(fā)現(xiàn)，患妊娠期糖尿病的患者臍靜脈變薄、管腔變大，管壁平滑肌纖維斷裂變性[17]。這些研究均提示糖尿病患者與非糖尿病患者的靜脈血管重構(gòu)存在顯著差異。本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠大隱靜脈中膜厚度較正常組明顯降低，管腔面積增大，膠原含量減少，證實糖尿病可以出現(xiàn)下肢靜脈形態(tài)結(jié)構(gòu)改變。

圖6 高糖培養(yǎng)后SMCV細胞內(nèi)外相關(guān)蛋白表達情況

以往研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者的SMCV在形態(tài)學(xué)上與非糖尿病患者不同，并且在高糖或晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs）刺激下，來源于SV的SMC表型改變往往比來源于動脈的SMC改變更為明顯[18]。Madi HA等人發(fā)現(xiàn)，相對于非糖尿病患者，糖尿病患者來源的SMCV表現(xiàn)為明顯的菱形表型，細胞面積擴大，伴有F-actin細胞骨架的破壞、α-SMA網(wǎng)絡(luò)的紊亂以及局灶性粘連的形成，對血清的反應(yīng)更具有移動性，但增殖受損[8，19-20]。然而，也有研究表明AGEs的積累和AGEs受體（RAGE）的激活可促進糖尿病患者SMC的增殖，促進MAP激酶家族（ERK、p38和JNK）磷酸化水平、MMP2和MMP9的轉(zhuǎn)錄表達、蛋白表達水平[21]。在大鼠靜脈移植研究中也發(fā)現(xiàn)，AGEs可以通過激活MAPKs通路同時促進SMCV的增殖和凋亡，進而促進移植靜脈的粥樣硬化[22]。本研究中，CCK8檢測結(jié)果提示高糖刺激后SMCV細胞活性顯著降低，此外，SMCV細胞內(nèi)外COLⅠ蛋白表達均顯著降低，COLⅢ蛋白表達無明顯差異，COLⅠ/COLⅢ表達比例下降，進一步研究發(fā)現(xiàn)，高糖刺激后細胞內(nèi)COLⅠmRNA無明顯變化，COLⅢmRNA表達下降，TIMP1蛋白表達下降，MMP2蛋白表達升高，提示高糖可能通過調(diào)控MMP2/TIMP1表達來抑制SMCV膠原表達參與靜脈病變。而刺激后SMCV內(nèi)TIMP1 mRNA表達升高，MMP2 mRNA表達下降，與蛋白表達變化趨勢不一致，提示高糖可能是通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方式如通過MicroRNA誘導(dǎo)基因沉默的機制調(diào)控MMP2/TIMP1及COL Ⅰ的表達參與靜脈病變。

綜上所述，本研究證實糖尿病下肢靜脈中膜變薄，管腔增大，膠原減少。在體外實驗中，高糖可以使SMCV細胞活性降低，COLⅠ蛋白表達下降、COLⅠ/COLⅢ蛋白表達比例下降，但其COLⅠmRNA表達無明顯變化，而細胞內(nèi)TIMP1蛋白表達減少，MMP2蛋白表達增多，可以推測高糖可能是通過轉(zhuǎn)錄后機制調(diào)控MMP2/TIMP1水平，影響SMCV細胞COLⅠ/COLⅢ的表達，抑制平滑肌細胞膠原合成，參與靜脈病變，其具體調(diào)控機制尚需進一步研究證實。