姜華 夏杰軍 趙軍陽 Fairooz 劉佩瑩 張靖

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤（retinoblastoma，RB）是兒童最常見的原發(fā)性眼內(nèi)惡性腫瘤。自2008年Abramson等[1]報(bào)道經(jīng)眼動(dòng)脈灌注化療（intraarterial chemotherapy，IAC）治療RB以來，IAC聯(lián)合局部治療（激光、球注、冷凍等）已經(jīng)成為RB的重要治療方法，提高了患兒的保眼率，但仍有部分患兒對(duì)IAC治療不敏感，需及早摘除眼球以避免腫瘤向眼球外轉(zhuǎn)移[2]。

目前，預(yù)測(cè)RB的保眼治療的療效僅是基于臨床的腫瘤分期，包括腫瘤大小、視網(wǎng)膜脫落和腫瘤種植等。然而最常用的RB腫瘤國(guó)際分期（intraocular international retinoblastoma classify，IIRC）對(duì)D期RB患兒的治療成功率的預(yù)測(cè)只有50%[3]，對(duì)E期RB患兒的預(yù)測(cè)更少[4]，因此臨床亟需一種更精準(zhǔn)的方法來評(píng)估和預(yù)測(cè)RB患兒的保眼臨床療效。

由于擔(dān)心腫瘤的針道種植轉(zhuǎn)移，只能從RB患兒眼球摘除后取標(biāo)本行基因測(cè)序及其他生物化學(xué)檢查，而不能像其他實(shí)體腫瘤一樣進(jìn)行活檢，因此RB的基因診斷與個(gè)性化治療受到很大限制。Jesse L等[5]發(fā)現(xiàn)RB房水的基因檢測(cè)可以用于替代腫瘤的活組織檢測(cè)來預(yù)測(cè)臨床療效，為精準(zhǔn)治療打開了大門[6-7]?；诖?，本研究通過檢測(cè)、比較RB眼球摘除后房水、腫瘤基因信息等，初步探討RB液體活檢的意義。

資料與方法

一、一般資料

本研究獲得了醫(yī)院倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)。治療前所有患兒監(jiān)護(hù)人都獲得了知情同意。本研究共納入2例保眼失敗的RB患兒。

病例1：男，5歲，右眼RB，IIRC E期，前房可見腫瘤種植，曾行1次經(jīng)眼動(dòng)脈灌注化療，眼底檢查示療效較差，予以眼球摘除。

病例2：男，4歲，右眼RB，IIRC D期，曾6次全身化療后腫瘤復(fù)發(fā)，經(jīng)3次經(jīng)眼動(dòng)脈灌注后腫瘤控制欠佳，出現(xiàn)玻璃體混濁，窺不清眼底，予以眼球摘除。

二、方法

眼球摘除后先吸取房水0.5 ml，再切取少量腫瘤組織。所有樣本避免溶血，取樣后立即保存于-80℃冰箱內(nèi)，在取樣后1個(gè)月內(nèi)完成檢測(cè)。

分別采用Amp Genomic DNA Kit（天根）和QIAseq cfDNA提取試劑盒（Qiagen）從RB患者中提取腫瘤組織的基因組（gDNA），以及房水cfDNA。gDNA經(jīng)過酶片段化，以50 ng片段化的gDNA使用KAPA hyperplus進(jìn)行酶切片段化，酶切時(shí)間選擇12 min，后經(jīng)平末端修復(fù)，5’磷酸化和3’加腺苷酸尾、DNA連接酶等模塊連接Illumina Truseq 接頭后通過P5、P7端引物擴(kuò)增后得到上機(jī)文庫(kù)。房水中分離的cfDNA采用相同的NGSDNA文庫(kù)制備方法，但前期無片段化處理過程，采用10 ng cfDNA構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。純化的測(cè)序文庫(kù)由Illumina noveseq 6000平臺(tái)進(jìn)行全基因組低覆蓋度的高通量測(cè)序。在獲得測(cè)序原始數(shù)據(jù)后，每條測(cè)序序列以95%以上堿基質(zhì)量≥28分為閾值基準(zhǔn)，利用Fastp質(zhì)控及過濾工具（https://github.com/OpenGene/fastp）進(jìn)行過濾，通過質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的片段序列（reads）進(jìn)一步運(yùn)用BWA軟件（http://biobwa.sourceforge.net/bwa.shtml）與人參考基因組（hg19）進(jìn)行比對(duì)。根據(jù)比對(duì)結(jié)果，計(jì)算出相對(duì)于參考基因組的測(cè)序深度和覆蓋度。采用ichorCNA（https://github.com/broadinstitute/ichorCNA/）對(duì)樣本的染色體拷貝數(shù)變異和腫瘤分?jǐn)?shù)進(jìn)行分析。ichorCNA是一種基于隱馬爾可夫模型（HMM）預(yù)測(cè)超低通量全基因組測(cè)序（ulp-wgs）的染色體拷貝數(shù)變異和腫瘤分?jǐn)?shù)(tumor fraction，TFx)的方法。

本研究采用ichorCNA以1 Mbp為長(zhǎng)度單位將基因組分割成不相重疊的窗口（1m-bin），在分析過程中過濾DNA重復(fù)區(qū)域、低覆蓋區(qū)域及GC校正后，提取每個(gè)窗口中reads數(shù)目，將常染色體平均reads數(shù)設(shè)為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，計(jì)算每個(gè)窗口中樣本與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照的reads數(shù)的倍數(shù)關(guān)系，作log2 ratio值計(jì)算，預(yù)測(cè)每個(gè)樣本中的腫瘤DNA含量以及拷貝數(shù)變異。

結(jié) 果

一、樣本的質(zhì)量評(píng)估

兩個(gè)病例的腫瘤組織和房水樣本的DNA質(zhì)量良好（圖1～2）。

二、全基因低覆蓋度測(cè)序和染色體拷貝數(shù)變異分析

圖1 兩個(gè)腫瘤組織樣本的DNA質(zhì)量良好

圖2 房水的cfDNA質(zhì)量良好，cfDNA片段大小在理想范圍內(nèi)

以人的基因組hg19作為參考基因組對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。hg19基因組大小是3 095 677 412 bp，有效基因組大小為2 861 327 131 bp（參考序列中不含N）。我們應(yīng)用BWA軟件，分別將各個(gè)樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)到參考基因組上。4個(gè)樣本的有效reads比對(duì)率介于78.22%～88.23%之間，平均測(cè)序深度介于0.27 X～0.36 X之間。

圖3顯示了所有染色體的每個(gè)1M-bin的聚集歸一化覆蓋率統(tǒng)計(jì)的結(jié)果。兩個(gè)患者的房水cfDNA中，最常見的拷貝數(shù)增加的基因組區(qū)域包括1q、6p和13q，最常見的拷貝數(shù)缺失區(qū)域包括6q、8p。

在病例1患兒中，房水和腫瘤樣本的基因組拷貝數(shù)增加的區(qū)域高度一致，都出現(xiàn)了1q、6p以及13號(hào)和18號(hào)全染色體區(qū)域的擴(kuò)增。腫瘤組織在15q區(qū)域也有顯著的拷貝數(shù)增加。分析顯示病例2患兒的腫瘤組織比例過低（TF=0.09 276），因此低覆蓋度高通量測(cè)序未能很好地反應(yīng)其染色體拷貝數(shù)變異的情況。該患兒房水樣本在1p、6q、8p和13q區(qū)域有基因組拷貝數(shù)變異，在17p和19q染色體區(qū)域出現(xiàn)了微缺失區(qū)域。

討 論

圖3 腫瘤和前房液ichorCNA分析結(jié)果

早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療能夠降低視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤患兒的死亡率、提高其保眼率，乃至保留有用的視力。經(jīng)眼動(dòng)脈灌注化療、玻璃體腔注射化療等保眼治療方法的出現(xiàn)，提高了患兒的保眼率，使得大量以往需摘眼球的患兒得以保存眼球，也使得這部分患兒不能以病理檢查來評(píng)估疾病擴(kuò)散以及預(yù)后的危險(xiǎn)因素，因次找到更加精準(zhǔn)的RB診斷工具對(duì)RB保眼治療的療效以及預(yù)后評(píng)估變得非常迫切。

與其他部位的惡性腫瘤相比，RB的一個(gè)顯著區(qū)別在于，其臨床分期不是基于病理檢查或者活檢，也無任何遺傳腫瘤標(biāo)記物的參考。 盡管如此，通過研究眼球摘除后的腫瘤發(fā)現(xiàn)：絕大多數(shù)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤（98%）是由13q染色體上RB1腫瘤抑制基因的兩個(gè)等位基因失活引起的，RB體細(xì)胞拷貝數(shù)主要改變表現(xiàn)為1q、2p、6p 染色體拷貝數(shù)增加，13q、16q 染色體缺失以及2p 染色體局部擴(kuò)增[8]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)1q、6p拷貝數(shù)增加和16q缺失可能與局部侵襲性疾病有關(guān)[9]；而且 6p拷貝數(shù)增加與分化程度較低的腫瘤有較高的視神經(jīng)侵犯率有關(guān)[10]。然而，由于為了避免RB的眼外腫瘤轉(zhuǎn)移而禁止侵入性組織活檢，從而限制了這些研究結(jié)果的臨床應(yīng)用，不能評(píng)估和預(yù)測(cè)RB的保眼率。

1971年，Dias等[11]首先在RB患兒摘除后的眼球房水中發(fā)現(xiàn)了乳酸脫氫酶（LDH），且活性的增加與疾病的進(jìn)展有關(guān)，作者認(rèn)為這可能有助于診斷。在該初步報(bào)告之后幾十年中，許多研究都在眼球摘除后檢測(cè)房水，并發(fā)現(xiàn)了各種標(biāo)記物，為診斷、臨床病理相關(guān)性及可能的靶向治療做出有益的探索，但是，由于這些研究都是從眼球摘除后的眼中進(jìn)行的，因此房水檢測(cè)在RB的診治中的作用仍然有限。

Berry等[5]在晚期RB患兒的房水中發(fā)現(xiàn)了RB腫瘤游離DNA，且與眼球摘除后腫瘤組織獲得的基因組圖譜一致，該研究表明房水基因檢測(cè)有可能替代腫瘤活檢，直接作為腫瘤診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，并且提示腫瘤遺傳信息。而且進(jìn)一步的后續(xù)分析表明，RB患兒房水中cfDNA的基因組評(píng)估具有重大的預(yù)后潛力[12]。在該研究中，8位RB患兒房水的cfDNA濃度范圍為0.084～56 ng/ul，接受美法侖治療的患眼的平均cfDNA濃度為0.2 ng/ul，而未經(jīng)治療直接眼球摘除的房水內(nèi)的腫瘤的濃度要高得多（平均43.6 ng/ul）。此外，房水cfDNA檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)6p染色體的增加與腫瘤活性有關(guān)，提示這可以作為保眼治療失敗致眼球摘除的預(yù)測(cè)方法。房水的基因檢測(cè)為RB保眼治療的療效評(píng)估和預(yù)后預(yù)測(cè)開啟了精準(zhǔn)治療的大門[13]。經(jīng)過對(duì)兩例患兒眼球摘除后房水、腫瘤組織的基因信息比對(duì)，發(fā)現(xiàn)這兩種組織的基因組圖譜一致，并且與Berry團(tuán)隊(duì)的研究基本相似。

綜上，盡管本研究只有2例標(biāo)本，但是結(jié)果仍是令人振奮的，國(guó)內(nèi)首次在RB患兒房水中提取cfDNA，期待進(jìn)一步研究來預(yù)測(cè)腫瘤的療效和預(yù)后，這將大大改善視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的臨床實(shí)踐，房水活檢有望成為視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤診斷治療的新標(biāo)準(zhǔn)，使得RB的精準(zhǔn)治療成為可能。

致謝：感謝洛杉磯兒童醫(yī)院Jesse L.Berry、Liya Xu教授以及上海福君基因生物科技有限公司對(duì)本研究的支持和幫助。