袁秀云 許申平 張燕 王默霏 蔣素華 梁芳 崔波

摘? 要：為研究蝴蝶蘭對低溫脅迫分子調(diào)控的機理，采用RT-PCR和RACE方法，從蝴蝶蘭葉片中克隆到一個親環(huán)素基因PhCyP（登錄號為MH992514），其基因cDNA全長序列為829?bp，開放閱讀框長度為522?bp，編碼173 個氨基酸，其編碼蛋白含有一個類親環(huán)素（CLD）保守結(jié)構域，為堿性親水性蛋白。系統(tǒng)進化分析顯示，蝴蝶蘭PhCyP蛋白與蘭科植物小蘭嶼蝴蝶蘭、萬帶蘭、深圳擬蘭、鐵皮石斛等親環(huán)素蛋白親緣關系較近。轉(zhuǎn)錄表達分析表明，PhCyP基因在蝴蝶蘭不同發(fā)育時期的根、葉、花梗、花器官、子房、種子等組織中有高豐度表達。在13?℃/8?℃（晝/夜）溫度條件下，PhCyP基因的表達水平先降低，處理6 d時降至最低，隨后逐漸升高至恢復培養(yǎng)。在4?℃低溫條件下，PhCyP基因的表達水平升高，在處理4 h升至最高，然后逐漸下降，在處理48 h其表達低于處理前水平。以上結(jié)果表明，PhCyP基因參與蝴蝶蘭對低溫脅迫的響應，且對不同低溫脅迫具有不同的分子調(diào)控機制。

關鍵詞：蝴蝶蘭;低溫;親環(huán)素;基因表達

中圖分類號：S682.31;Q786????? 文獻標識碼? A

Abstract： To study the molecular regulation mechanism of Phalaenopsis in response to low temperature stress， a cyclophilin gene PhCyP （GenBank accession number： MH992514） was cloned from the leaf of Phalaenopsis through the RT-PCR and RACE method. The full-length cDNA sequence was 829 bp with an open reading frame （ORF） of 522 bp encoding 173 amino acids. PhCyP contained a cyclophilin-like domain （CLD） with alkaline and hydrophilic properties. The phylogenetic tree showed that PhCyP was closely related to the cyclophilin from Phalaenopsis equestris， Vanda hybrid cultivar， Apostasia shenzhenica and Dendrobium catenatum in Orchidaceae. The expression analysis showed that PhCyP was highly expressed in different tissues including root， leaf， flower， ovary and seed in different development stage. Under 13?℃/8?℃ day/night temperature， the expression level of PhCyP reduced gradually with treatment time and was the lowest at 6 d， then increased gradually from 9 d to restoring. Under 4?℃ treatment， the expression level of PhCyP increased gradually， and achieved the highest level at 4 h， then its expression level decreased gradually with a lower level than that before treatment at 48 h. The results suggested that PhCyP was involved in the response to low temperature stress with different molecular regulation mechanism to different low temperature stress.

Keywords： Phalaenopsis spp.; low temperature; cyclophilin; gene expression

蝴蝶蘭（Phalaenopsis spp.）屬于蘭科（Orchidaceae）蝴蝶蘭屬（Phalaenopsis）植物，原產(chǎn)于熱帶和亞熱帶。因花型優(yōu)美奇特、花期長，具有較高的觀賞價值，在我國南方和北方各地均有栽培。但不管在南方或北方，蝴蝶蘭的種植均需盆栽，且需在溫室進行精細的溫濕度管理，以滿足其生長必須的溫濕環(huán)境和花期調(diào)控條件。因此，培育有較高的觀賞性狀、又有較強抗逆性品種，特別是培育抗冷性品種是蝴蝶蘭引種栽培、降低成本的一條捷徑。研究表明，適當?shù)囊归g低溫能夠誘導蝴蝶蘭生殖發(fā)育相關基因的表達以促進開花[1]，而大部分蝴蝶蘭品種的耐受極限夜溫為9?℃以下[2]。不同耐冷性蝴蝶蘭在低溫脅迫下其葉綠素含量、丙二醛含量、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶、過氧化氫酶活性及光合生理等參數(shù)均具有差異性響應特征[2-3]。同時，低溫脅迫也會誘導逆境響應蛋白的差異表達[4]。一些基因如Rubisco活化酶基因PhRCAα[5]、莖部特異基因PhTSJT1[6]等能夠參與低溫脅迫的調(diào)控，使蝴蝶蘭在低溫脅迫的早期表現(xiàn)一定的耐受性和適應性。由此可見，研究一些逆境調(diào)控基因及其功能將為利用基因工程手段進行分子育種奠定基礎。

親環(huán)素（cyclophilin）是親免素家族的一員，與環(huán)孢素A（cyclosporineA， CsA）高度親和，具有肽基脯氨酰順反異構酶（peptidyl-prolyl cis- trans-isomerase， PPIase）活性，能夠催化脯氨酸肽鍵的順-反異構化[7]。親環(huán)素具有一個類親環(huán)素（cyclophilin-like domain， CLD）保守結(jié)構域，除此之外，在其N端或C端還有一些特異序列，與亞細胞定位等細胞特定功能有關[8]。親環(huán)素是一個多功能蛋白家族，廣泛分布于細菌、病毒、真菌、動物及植物等有機生物體中，定位于細胞核、細胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、葉綠體、線粒體、液泡、高爾基體及分泌途徑等亞細胞場所[9-10]。據(jù)報道，植物中存在多種同工型親環(huán)素蛋白，其參與蛋白的折疊和轉(zhuǎn)運[11-12]、信號轉(zhuǎn)導[13-14]、免疫調(diào)節(jié)[15-17]、細胞凋亡[18]等多種重要的生理生化過程。由于親環(huán)素在植物各種組織中的普遍表達，親環(huán)素基因常作為動植物基因表達研究的候選內(nèi)參基因[19-21]。而近年來的研究表明，植物親環(huán)素基因參與干旱[22]、高鹽[23-24]及低溫[25-26]等多種逆境脅迫的調(diào)控，是一個逆境脅迫調(diào)控蛋白。迄今為止，在擬南芥[18]、大豆[27]、油菜[28]等多種植物中已分離出多個親環(huán)素基因及其同工型，而蝴蝶蘭親環(huán)素基因的研究還未見報道。因此，本研究用RT-PCR和RACE方法，從蝴蝶蘭葉片中克隆一個親環(huán)素基因的全長序列進行生物信息學分析，并利用實時熒光定量方法檢測其在蝴蝶蘭不同組織及低溫脅迫下的轉(zhuǎn)錄表達水平，研究結(jié)果將為進一步研究親環(huán)素基因的功能及應用奠定基礎。

1? 材料與方法

1.1? 材料

蝴蝶蘭栽培品種：‘聚寶紅玫瑰和‘滿天紅，其均種植于鄭州師范學院智能溫室。

取‘聚寶紅玫瑰4個發(fā)育時期的15種組織為試驗材料，包括幼苗期的根和葉片，開花前期的根、葉片和花梗，盛花期的根、葉片、花梗、萼片、花瓣、唇瓣、蕊柱、授粉前子房，授粉后的發(fā)育中子房、果實成熟時的種子等材料。將‘滿天紅幼苗在光照培養(yǎng)箱中進行13?℃/8?℃（晝/夜）溫度（12 h/12 h 晝/夜光照）培養(yǎng)，隨后進行27?℃/22?℃（晝/夜）及12 h/12 h 晝/夜光照恢復培養(yǎng)。在冰箱中進行4?℃低溫處理。分別于13?℃/ 8?℃溫度條件下的0、1、3、6、9、15 d及恢復培養(yǎng)條件下的1和3 d取第2葉片組織;4?℃低溫條件取0、0.5、1、2、4、8、12、24、48 h的第2葉片組織。每種組織及處理設3個生物學重復，所取樣品用液氮速凍，放于?80?℃冰箱備用。

1.2? 方法

1.2.1? RNA提取和cDNA合成? 蝴蝶蘭不同組織的總RNA采用TRIzol Reagent（Ambion）提取，‘聚寶紅玫瑰幼苗期葉片總RNA用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶（TaKaRa）合成cDNA，用于PhCyP基因克隆。實時熒光定量PCR所用cDNA用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（Takara）合成，稀釋10倍備用。

1.2.2? 蝴蝶蘭PhCyP基因的克隆? 根據(jù)NCBI上登錄的同源序列（XM_020833376、KP719975、KU942511、XM_020728710、GU942927）設計1對簡并引物CyP-F和CyP-R，用于中間片段的擴增，預期452?bp，PCR擴增體系為25 μL，含10×buffer 2.5 μL，cDNA模板1000～2000?ng，dNTP 600 μmol/L，每條引物0.5?μmol/L，TaqDNA聚合酶1 U。擴增程序為：95?℃變性5 min;95?℃ 30 s，58?℃ 30 s，72?℃ 30?s，35個循環(huán);72?℃延伸10 min。凝膠回收目的片段，連接到pGEM-T EASY載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，進行測序。根據(jù)中間片段設計3端特異引物3-outer和3-inner，5端特異引物5-outer和5-inner，采用SMARTTM RACE Amplification kit（Clontech）進行目的基因的RACE擴增。將5端序列、中間序列和3端序列拼接，獲得目的基因cDNA的全長。在此基礎上，設計1對引物ORFF和ORFR，跨越開放閱讀框（ORF），預期691 bp，進行ORF的擴增和測序，進一步進行序列驗證。引物設計和序列拼接采用Primer 5.0和DNAMAN軟件，引物合成和測序由上海英濰捷基公司完成。

1.2.3? 蝴蝶蘭PhCyP基因的生物信息學分析? 在NCBI上通過ORF Finder在線分析序列開放閱讀框。PhCyP基因的核苷酸序列采用Blast進行分析。蛋白結(jié)構域分析利用PROSITE（https：//prosite. expasy.org/scanprosite/）進行。PhCyP基因編碼蛋白的理化性質(zhì)和二級結(jié)構采用ExPASy網(wǎng)站進行在線預測。采用Phyre2軟件進行三級結(jié)構預測。采用WoLFPSORT軟件進行亞細胞定位預測?？缒そY(jié)構采用TMHMM-2.0進行分析。利用ClustalX軟件對氨基酸序列進行完全比對，并在MEGA 5.0軟件上采用鄰接法構建系統(tǒng)進化樹。

1.2.4? 蝴蝶蘭PhCyP基因的表達分析? 根據(jù)PhCyP基因編碼區(qū)序列設計1對特異引物qRT-F和qRT-R，以蝴蝶蘭Actin（JN185655）為內(nèi)參基因，引物為Actin-F和Actin-R，采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ kit （TaKaRa）進行實時熒光定量PCR反應，反應體系為25 μL，反應條件為：95?℃3 min，95?℃15 s，58?℃15 s，72?℃15 s（40個循環(huán)）。反應在熒光定量PCR儀（Eppendorf）上進行，每個反應重復3次。引物特異性通過溶解曲線分析并測序驗證，相對表達量按照2ΔΔCT法計算，表達差異通過SPSS 20.0軟件進行顯著性分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 蝴蝶蘭PhCyP基因的克隆

以幼苗期蝴蝶蘭葉片cDNA為模板，利用簡并引物CyP-F和CyP-R進行PCR擴增，預期得到了一個452 bp的片段（圖1A），該片段與多種植物的肽基脯氨酰順反異構酶基因或親環(huán)素基因具有76%～98%的一致性。5 RACE和3 RACE擴增結(jié)果分別得到一個607 bp（圖1B）和398 bp（圖1C）的片段，將其片段進行拼接得到一個829 bp的序列，ORF片段（圖1D）的測序結(jié)果與拼接序列完全一致。其序列的ORF長度為522?bp，編碼173 個氨基酸，5端非編碼區(qū)（5- UTR）和3端非編碼區(qū)（3-UTR）分別為49和258 bp（圖2）。將PhCyP序列進行核苷酸Blast搜索，結(jié)果表明，其序列與小蘭嶼蝴蝶蘭的肽基脯氨酰順反異構酶基因（XM_020728710）具有98%的一致性，與萬帶蘭的親環(huán)素基因（GU942927）具有94%的一致性，與鐵皮石斛（XM_020833376）和常春藤（KU942511）的肽基脯氨酰順反異構酶基因序列的一致性分別為85%和80%。因此，將其序列命名為PhCyP，登錄在NCBI網(wǎng)站，登錄號為MH992514。

2.2? 蝴蝶蘭PhCyP基因的生物信息學分析

PhCyP基因編碼的蛋白通過Blastp分析顯示，PhCyP基因編碼蛋白與蘭科植物小蘭嶼蝴蝶蘭的PPIase有98%的一致性，與萬帶蘭的親環(huán)素蛋白有97%的一致性，與深圳擬蘭和鐵皮石斛PPIase的一致性均為90%，與山萮菜PPIase的一致性為88%。該蛋白在5～170位氨基酸殘基之間包含一個CLD結(jié)構域（圖3），其包含PPIase特征基序和6個活性位點（圖2，圖3），屬于親環(huán)素超家族成員。以上結(jié)果表明，蝴蝶蘭PhCyP基因編碼蛋白具有保守的CLD結(jié)構域，為單結(jié)構域（single domain， SD）親環(huán)素類型，具有PPIase活性。

預測結(jié)果顯示，蝴蝶蘭PhCyP基因編碼蛋白的分子量為18.31?kDa，理論等電點為8.69，疏水性最大值為1.344，最小值為2.233（圖4A），無跨膜結(jié)構和信號肽，亞細胞定位于胞質(zhì)，為堿性親水性蛋白。二級結(jié)構預測，其蛋白有39.31%的無規(guī)則卷曲、30.64%的延伸鏈，18.50%的α-螺旋和11.56%的β-轉(zhuǎn)角（圖4B）。三級結(jié)構預測結(jié)果顯示，蝴蝶蘭PhCyP蛋白與?？苿游镉H環(huán)素蛋白cyclophilin 40（模板clihgA）具有99%的覆蓋率和100%的一致性（圖4C）。二級結(jié)構和三級結(jié)構預測結(jié)果表明，在PhCyP蛋白空間結(jié)構中，無規(guī)則卷曲和延伸鏈是主要的結(jié)構元件。

A：二級結(jié)構預測;B：疏水性分析;C：三級結(jié)構預測。

A： Secondary structure prediction; B： Hydrophobicity analysis; C： Three-dimensional structure prediction.

為進一步了解蝴蝶蘭PhCyP蛋白的系統(tǒng)進化，選擇一致性較高的親環(huán)素蛋白構建進化樹（圖5）。結(jié)果表明，15種植物中親環(huán)素蛋白進化樹分為2個大的分支，其中1個分支包括十字花科的山萮菜、擬南芥和琴葉擬南芥、錦葵科的陸地棉和雷德蒙氏棉、薔薇科的白梨、甜櫻桃和月季聚、胡麻科的芝麻和豆科的大豆，以上植物均為雙子葉植物，且同科植物的親環(huán)素蛋白很明顯聚在一起。另1分支包括蘭科植物蝴蝶蘭、小蘭嶼蝴蝶蘭、萬帶蘭、鐵皮石斛和深圳擬蘭。其中蝴蝶蘭的親環(huán)素蛋白與小蘭嶼蝴蝶蘭的PPIase親緣關系最近，與鐵皮石斛和深圳擬蘭的親環(huán)素蛋白關系稍遠。以上結(jié)果可以看出，親環(huán)素蛋白在單子葉植物和雙子葉植物中比較保守，其進化具有明顯的種屬特異性。

2.3? 蝴蝶蘭PhCyP基因的表達分析

PhCyP基因在不同發(fā)育時期的不同組織中均有表達，相對表達水平在0.69～1.00之間（圖6）。在各種組織中，PhCyP基因的表達水平?jīng)]有顯著性差異，其說明PhCyP基因在不同組織中為組成型表達，在不同發(fā)育時期的不同組織中，表達水平相對穩(wěn)定。

在13?℃/8?℃（晝/夜）條件下，PhCyP基因的表達水平隨低溫處理逐漸降低，6 d時下降到最低，6 d后其表達水平逐漸升高，升高趨勢一直維持到恢復培養(yǎng)的3 d（圖7）。

1：幼苗期根;2：幼苗期葉;3：花前期根;4：花前期葉;5：花前期花梗;6：盛花期根;7：盛花期葉;

8：盛花期花梗;9：花萼;10：花瓣;11：唇瓣;12：蕊柱;13：授粉前子房;14：發(fā)育中子房;15：種子。

1： Root at seedling stage; 2： Leaf at seedling stage; 3： Root at pre-flowering stage;

4： Leaf at pre-flowering stage; 5： Pedicel at pre-flowering stage; 6： Root at full-blossom stage;

7： Leaf at full-blossom stage; 8： Pedicel at full-blossom stage; 9： Sepal; 10： Petal; 11： Lip; 12： Column;

13： Ovary before pollination; 14： Developing ovary; 15： Seed.

在4?℃低溫脅迫條件下，PhCyP基因的表達水平在處理的0.5、1、2、4 h內(nèi)逐漸升高，在4?h時升至最高，隨后其表達水平逐漸下降，至處理48 h表達水平下降到最低，表達水平只有處理前的一半（圖8）。在馴化低溫條件下，PhCyP基因在前期表達水平下降，后期表達水平升高，而在4?℃冷脅迫條件下，其表達水平前期升高，后期表達水平下降。以上結(jié)果說明，低溫馴化和短期的冷脅迫能夠誘導PhCyP基因的表達以適應低溫條件以及避免冷脅迫的傷害。

3? 討論

本研究在蝴蝶蘭中克隆到一個親環(huán)素基因PhCyP，其編碼蛋白含有1個單結(jié)構域類型的CLD結(jié)構域。在蝴蝶蘭不同發(fā)育時期和組織中，PhCyP基因具有較高表達水平。馴化低溫條件下，PhCyP基因的轉(zhuǎn)錄表達先降低后升高，冷脅迫低溫條件下，其表達呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。

研究表明，同種植物具有多個親環(huán)素家族成員，如大豆中有62個親環(huán)素基因[27]，歐洲油菜中有94個親環(huán)素基因編碼，91種親環(huán)素蛋白[28]。其成員分布在細胞質(zhì)、細胞核、葉綠體、線粒體及分泌途徑等亞細胞單位。氨基酸序列分析表明，親環(huán)素有單功能域型和多功能域型，單功能域型只有1個CLD結(jié)構域，多功能域型除了1個CLD功能域外，還有跨膜結(jié)構域、核定位信號區(qū)、RNA 識別基序、四聯(lián)重復肽、亮氨酸拉鏈結(jié)構等結(jié)構，參與蛋白互作或其它功能[29]。本研究中，蝴蝶蘭PhCyP基因編碼蛋白為單功能域型親環(huán)素蛋白，在N端有PPIase的特征序列，具有PPIase功能。

據(jù)報道，親環(huán)素基因常作為動植物研究中常用的內(nèi)參基因之一[19-21]。對馬鈴薯多個內(nèi)參基因的穩(wěn)定性研究表明，鹽脅迫條件下，馬鈴薯親環(huán)蛋白基因 CYP2表達最為穩(wěn)定[30]。對大豆的10個常用內(nèi)參基因（ACT2/7、ACT11、TUA、TUB、EF1α、UBC2、ELF1b、CYP2、G6PD、UBQ10）研究顯示，親環(huán)蛋白基因（CYP2）和延伸因子1b（ELF1b）在21個不同發(fā)育時期和組織器官等樣本中的表達最為穩(wěn)定，是表達最為穩(wěn)定的內(nèi)參基因[31]。Coker等[32]統(tǒng)計分析番茄EST數(shù)據(jù)庫中的127個基因在不同cDNA文庫中的出現(xiàn)頻率，并據(jù)此來判斷基因的表達穩(wěn)定性，親環(huán)素基因也是5個穩(wěn)定性最好的基因之一。在蝴蝶蘭內(nèi)參基因穩(wěn)定性表達研究中[33]，還未見親環(huán)素基因的報道。本研究結(jié)果表明，PhCyP基因在不同發(fā)育階段和組織中均有較高豐度的表達，且表達水平基本一致。通常來說，PhCyP基因可作為正常生長條件下相關基因研究的候選內(nèi)參基因，然而其基因的表達對環(huán)境溫度較敏感，其表達水平隨不同的低溫脅迫發(fā)生變化，顯然，低溫脅迫下，親環(huán)素基因不適合作為內(nèi)參基因。

諸多研究已經(jīng)證明，親環(huán)素是一個逆境調(diào)控蛋白[22-26]。關于親環(huán)素基因?qū)Φ蜏孛{迫的響應，早在1992年Marivet[34]的研究中已被證明，親環(huán)素基因能被低溫誘導上調(diào)表達。相同的結(jié)果也在野生馬鈴薯中得到驗證[35]。對水稻親環(huán)素基因研究發(fā)現(xiàn)，OsCYP19-4基因響應冷脅迫被上調(diào)表達，在水稻中過表達該基因能增強水稻對低溫的抗性[26]。隨后的研究表明，OsCYP19-4通過可變剪切產(chǎn)生4個轉(zhuǎn)錄本，其中OsCYP19-4.2和OsCYP19- 4.3通過與生長素途徑相關因子RCN1互作在冷脅迫中發(fā)揮重要作用[36]。在低溫誘導差異蛋白的研究中，也常常發(fā)現(xiàn)親環(huán)素蛋白能被低溫誘導，例如花生在低溫脅迫下親環(huán)素蛋白被上調(diào)表達，并在轉(zhuǎn)錄水平得到驗證[37]。

本研究中蝴蝶蘭在13?℃/8?℃條件下，其PhCyP基因的表達先降低，而后逐漸升高至恢復后。其表明該基因在后期（9 d）逐漸啟動適應這一低溫脅迫的調(diào)控，且增強了蝴蝶蘭對馴化低溫的抵抗能力。在4?℃冷脅迫條件下，PhCyP基因的表達先升高后降低，在4 h時調(diào)控水平達到最高，隨后其表達水平逐漸下降，至到48 h時下降到低于處理前的水平。其結(jié)果表明，PhCyP基因受到脅迫就啟動避免冷脅迫的調(diào)控，調(diào)控持續(xù)一定時間后，其表達水平由于植株受到嚴重損傷或植株逐漸死亡而降低。其結(jié)果與前期研究的PhRCAα基因和PhTSJT1基因?qū)涿{迫的響應結(jié)果相似[5-6]。前人研究表明，當夜溫在9?℃以上時， 大部分蝴蝶蘭的葉綠體和光合機構不會受到嚴重傷害，SOD活性呈現(xiàn)持續(xù)升高的趨勢，植株轉(zhuǎn)入正常生長溫度下可得到恢復。而當夜溫在6?℃時，長時間的脅迫植株則會受到嚴重傷害，逐漸出現(xiàn)明顯的凍斑、失綠等冷害癥狀[3]，且轉(zhuǎn)入正常生長溫度下不能完全恢復[2]。在低溫脅迫條件下PhCyP基因的轉(zhuǎn)錄表達與生理代謝變化的趨勢一致。本研究分析發(fā)現(xiàn)，蝴蝶蘭在不同低溫脅迫下，眾多因素參與對低溫脅迫的響應和調(diào)控，并表現(xiàn)出不同的調(diào)控機制。短時間（4 h）的冷脅迫能夠誘導PhCyP基因的表達啟動其抗冷脅迫的調(diào)控。而當蝴蝶蘭長時間受到冷脅迫后，由于光合機構的破壞及抗氧化酶系統(tǒng)的失活[2-3]，最終導致植株不可逆的損傷。由于親環(huán)素是一個蛋白家族，其種類與功能多樣，蝴蝶蘭其它的親環(huán)素基因成員及功能的挖掘?qū)胬斫馄湓谥参锷砘顒又械墓δ?，并為進一步研究及應用奠定基礎。

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