段雅婕 梅志剛 孫德權(quán) 李偉明 龐振才 胡會剛

摘? 要：FS-4是1株對香蕉枯萎病菌有較好拮抗作用的放線菌。以高氏一號培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，通過單因素和響應(yīng)面實驗進(jìn)行了相關(guān)優(yōu)化，對FS-4菌株的發(fā)酵工藝進(jìn)行篩選。結(jié)果表明：0.5%蛋白胨，2.4%蔗糖，0.05%的磷酸氫二鉀、氯化鈉和硫酸鎂，發(fā)酵溫度28?℃，初始pH為7為最佳培養(yǎng)基配方及最優(yōu)發(fā)酵條件。發(fā)酵62 h后，發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)活性達(dá)到最高水平，對香蕉枯萎病菌的抑菌圈直徑達(dá)到27.1 mm。

關(guān)鍵詞：放線菌菌株FS-4;發(fā)酵工藝;響應(yīng)面法

中圖分類號：Q949.748.5????? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Abstract： The screening of antagonistic bacteria from soil microorganisms in the areas with banana Fusarium wilt is of great practical significance for controlling this disease. In this report， a strain， designated FS-4， was isolated from healthy banana rhizosphere soil in the area affected by Fusarium wilt. Based on Gauses No. 1 synthetic medium， the optimization of medium， single factor experiments and response surface experiments were conducted to maximize the production of the antibacterial substances of actinomycete FS-4. The best fermentation medium and fermentation conditions were as follows： sucrose 2.4%， peptone 0.5%， K2HPO4 0.05%， NaCl 0.05%， MgSO4 0.05%， fermentation temperature 28 ℃， initial pH 7. Under the conditions， the inhibition zone diameter of actinomycete FS-4 fermentation filtrate reached 27.1 mm on the test plates of Bacillus subtilis after 62 h incubation

Keywords： actinomycetes FS-4; fermentation conditions; response surface method

由尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum f. sp. cubense）侵染引起的枯萎病是香蕉種植中的毀滅性病害，對相關(guān)產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要影響[1]。抗病育種、化學(xué)農(nóng)藥、輪作等方法在對香蕉枯萎病的防治中均存在不同的缺陷，難以規(guī)?；茝V應(yīng)用。利用包括拮抗微生物在內(nèi)的生物防治方法具有安全、環(huán)保、經(jīng)濟(jì)效益高等優(yōu)點，是當(dāng)前該類病害防治研究中的熱點[2]。FS-4是本團(tuán)隊從香蕉枯萎病發(fā)病田土壤中分離篩選出的1株放線菌，其對香蕉枯萎病菌具有較好拮抗作用[3-4]。

本團(tuán)隊采用16S rDNA 序列分析其放線菌為曼尼普爾鏈霉菌（Streptomyces manipurensis），命名為曼尼普爾鏈霉菌FS-4（Streptomyces manipurensis FS-4）[3-4]。采用國際鏈霉菌規(guī)劃中的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基（1976），28?℃培養(yǎng)7～21 d，觀察FS-4菌株培養(yǎng)特征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：FS-4菌株能使硝酸鹽還原，淀粉水解，能產(chǎn)生H2S、黑色素、尿素酶和酪氨酸酶，但不能使明膠液化、牛奶胨化與凝固。生長pH范圍為5.0～10.0，最適生長pH為7.0。最適生長溫度為28～32?℃，不能生長在NaCl含量大于3%的培養(yǎng)基。FS-4菌株對香蕉枯萎病1號（Foc 1）和4號（Foc 4）小種均有拮抗作用，對香蕉枯萎病菌1號小種的拮抗性較弱，顯著低于香蕉枯萎病菌4號小種，2者的抑菌帶寬度分別為12.07和15.12 mm。

菌株FS-4在人工培養(yǎng)條件下生長緩慢，制約了相關(guān)研究工作的進(jìn)行。響應(yīng)面分析法通過研究響應(yīng)輸出結(jié)果與影響因子之間的數(shù)學(xué)關(guān)聯(lián)模式，經(jīng)由設(shè)計者在所關(guān)心的試驗區(qū)域內(nèi)以系統(tǒng)的方式進(jìn)行試驗，最終得到所設(shè)想的響應(yīng)值和影響因子變化趨勢，是一類包含了數(shù)學(xué)應(yīng)用、統(tǒng)計處理和試驗設(shè)計的分析工具[5]，近年來在微生物發(fā)酵工藝研究中得到廣泛應(yīng)用。為更好地開展FS-4拮抗作用機(jī)理及其田間應(yīng)用研究，本研究采用響應(yīng)面分析法開展FS-4菌株的發(fā)酵工藝篩選研究。

1? 材料與方法

1.1? 材料

拮抗放線菌菌株FS-4和香蕉枯萎病菌菌株Foc 4由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所提供。高氏1號培養(yǎng)基和營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基參照王小琴等[6]的方法制備，相關(guān)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2? 方法

1.2.1? 菌株發(fā)酵和拮抗活性評價? 參照段雅婕等[3]和柯春亮等[4]的方法進(jìn)行。

1.2.2? 液體發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件的單因素分析[7-11]? 以高氏1號培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別以不同碳源（葡萄糖、蔗糖、玉米粉、乳糖）代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源（可溶性淀粉）。制備無菌發(fā)酵濾液后，采用牛津杯法評價拮抗物質(zhì)活性。獲得最佳碳源后，將含量調(diào)整為1%、2%、3%、4%和5%，篩選出最佳含量。在明確最佳碳源及其含量后，以0.1%的硫酸銨、硝酸鈉、酵母粉、蛋白胨代替原基礎(chǔ)培養(yǎng)基中硝酸鉀，篩選出最佳氮源。將最佳氮源含量調(diào)整為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，確定最佳含量。

將氯化鈉、磷酸氫二鉀和硫酸鎂含量分別調(diào)為0.025%、0.050%、0.075%、0.100%、0.125%，篩選出最佳含量。設(shè)置培養(yǎng)基初始pH為 5、6、7、8和9，發(fā)酵溫度為22、25、28、31和34?℃，發(fā)酵時間為48、72、96、120和144 h，分別篩選出最佳參數(shù)。

1.2.3? 響應(yīng)面分析法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件? 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選取蔗糖、蛋白胨、時間作為考察因素，以抑菌圈大小為響應(yīng)值，采用3因素3水平對放線菌FS-4最佳發(fā)酵條件進(jìn)行響應(yīng)面分析（表1）[12]。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

利用Design-Expert軟件進(jìn)行3因素3水平的Box-Behnken實驗設(shè)計。所有實驗均為3次重復(fù)，使用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)方差分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 單因素實驗結(jié)果

2.1.1? 碳源種類及含量對放線菌FS-4產(chǎn)抑菌物質(zhì)的影響? 以高氏一號培養(yǎng)基為基礎(chǔ)進(jìn)行碳源的優(yōu)化[13]，分別以蔗糖、乳糖、玉米粉、葡萄糖、可溶性淀粉作為碳源。結(jié)果表明，以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基，發(fā)酵液的抑菌圈直徑最大達(dá)到20.5 mm，表明蔗糖最有利于放線菌FS-4產(chǎn)生抑菌物質(zhì)（圖1）。在對蔗糖5個不同濃度處理的評價中，發(fā)現(xiàn)含量為2%時，發(fā)酵液產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)活性最強(qiáng)（圖2）。

2.1.2? 氮源種類及濃度對放線菌FS-4產(chǎn)抑菌物質(zhì)的影響? 以高氏1號培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，進(jìn)行了5種氮源的篩選[14-15]。以蛋白胨為碳源時，抑菌圈直徑最大，效果最好（圖3），而且當(dāng)?shù)鞍纂撕繛?.4%時，發(fā)酵液的抑菌物質(zhì)活性最高（圖4）。

不同小寫字母表示差異分析達(dá)到5%顯著水平。

2.1.3? 氯化鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂含量對放線菌FS-4產(chǎn)抑菌物質(zhì)的影響? 在高氏1號培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上進(jìn)行了無機(jī)鹽濃度的優(yōu)化，結(jié)果表明，3種無機(jī)鹽的不同濃度對放線菌FS-4抑菌物質(zhì)的活性影響不大（圖5）。

不同小寫字母表示差異分析達(dá)到5%顯著水平。

2.1.4? 初始pH、發(fā)酵溫度、時間對放線菌FS-4產(chǎn)抑菌物質(zhì)的影響? 圖中抑菌圈的直徑反映發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)的活性。篩選結(jié)果表明，初始pH在6～8、發(fā)酵溫度在22～31?℃范圍內(nèi)，無菌發(fā)酵液拮抗物質(zhì)活性活性最高，而48 h為發(fā)酵最適時間（圖6，圖7和圖8）。

2.2? 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果及分析

2.2.1? 響應(yīng)面結(jié)果? 如表2所示，本研究對17個實驗點進(jìn)行分析。其中，12個點是析因點，5個點（實驗號分別為1、5、8、10和17）用于計算實驗誤差的中心實驗點。

對回歸方程模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示?；貧w方程模型極顯著，表明模型建立可信。模型的決定系數(shù)為0.9604，表明3.96%的實驗數(shù)據(jù)不適合預(yù)測模型。模型的校正系數(shù)為0.9094，說明模型擬合程度良好，只有9.06%的實驗數(shù)據(jù)的變異性不能解釋。失擬項的P值是0.4386，不具有統(tǒng)計學(xué)差異，說明模型不需要引入更高次數(shù)的項。一次項A和C，二次項C2都達(dá)到極顯著水平，交互項AC，二次項A2都達(dá)到顯著水平。還可以得知3個因素對抑菌圈直徑大小的影響順序為：蛋白胨>蔗糖>時間。

2.2.3? 響應(yīng)面的分析與優(yōu)化[17-18]? 根據(jù)建立的回歸模型得到響應(yīng)曲面圖（圖9）。當(dāng)時間一定時，抑菌圈的直徑隨著蛋白胨和蔗糖含量的增加而變大，蛋白胨比蔗糖對抑菌圈直徑影響更大，兩者的交互作用不明顯。蔗糖含量在2.50%～3.00%，蛋白胨含量在0.45%～0.50%范圍內(nèi)，抑菌圈的直徑達(dá)到最大（圖9）。

當(dāng)蔗糖含量和時間一定時，抑菌圈的直徑與蛋白胨含量成正相關(guān)，而蔗糖和蛋白胨含量一定時，抑菌圈的直徑隨著時間的延長先增大后減小，兩者交互作用明顯。時間在56～64 h內(nèi)，蛋白胨含量在0.45%～0.50%范圍內(nèi)，抑菌圈的直徑達(dá)到最大（圖10）。

當(dāng)?shù)鞍纂撕亢蜁r間一定時，抑菌圈的直徑與蔗糖含量成正相關(guān)，但增長趨勢較緩。當(dāng)蔗糖和蛋白胨含量一定時，抑菌圈的直徑隨著時間的延長先增大后減小，說明超過一定發(fā)酵時間后，發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)活性會降低，且蔗糖和蛋白胨交互作用不明顯。時間在56～64 h內(nèi)，蛋白胨含量在2.50%～3.00%范圍內(nèi)，抑菌圈的直徑達(dá)到最大（圖11）。

2.2.4? 放線菌FS-4發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件的優(yōu)化和可靠性驗證? 通過Design-Expert V8.0.6軟件分析得到最佳條件為：蛋白胨含量0.5%，蔗糖2.37%，時間62.04 h。在此條件下，抑菌圈的理論直徑為27.46 mm。為簡化實驗操作，將條件修正為蛋白胨濃度0.5%，蔗糖濃度2.4%，時間62 h。實際得到抑菌圈直徑27.1 mm，與預(yù)測理論值相近。因此，得出的最佳條件具有較好的實用價值。

3? 討論

抗菌活性物質(zhì)通常作為拮抗放線菌發(fā)揮生物防治作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，其產(chǎn)量的高低影響著抑菌的實際效果[15， 19]。發(fā)酵是獲得大量微生物活性代謝產(chǎn)物的基礎(chǔ)，微生物代謝產(chǎn)物的類型和產(chǎn)量與其培養(yǎng)條件，如培養(yǎng)基中的碳源、氮源、pH等密切相關(guān)[20-21]，因此，探索出適宜的培養(yǎng)條件尤為關(guān)鍵。研究表明，不同培養(yǎng)基配方對菌株抑菌活性有較大影響[22-23]。程沁園等[24]研究的放線菌菌株WB-F以葡萄糖為碳源，黃豆粉為氮源時，單體積發(fā)酵液抑菌直徑提高了23.1%。朱宏建等[25]發(fā)現(xiàn)的放線菌菌株ND045在碳源為蔗糖、氮源為大豆粉時，菌株發(fā)酵濾液對辣椒尖孢炭疽病菌（Colletotrichum acutata）的抑菌率為35.2%。另外，發(fā)酵時間對放線菌FS-4產(chǎn)抑菌物質(zhì)也會產(chǎn)生影響。在本研究中，由圖8可知24 h的發(fā)酵液里已有抑菌物質(zhì)，當(dāng)發(fā)酵48 h后，抑菌圈直徑不再增加，說明放線菌FS-4基本停止產(chǎn)生抑菌物質(zhì)或者抑菌物質(zhì)的活性下降。

發(fā)酵工藝中的每一步、每個環(huán)節(jié)都至關(guān)重要。傳統(tǒng)的正交試驗設(shè)計、全因子試驗設(shè)計等手段優(yōu)化微生物發(fā)酵工藝，實驗工作量較大，結(jié)果也不全面。而響應(yīng)面法能很好地對影響發(fā)酵工藝過程中的培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件等進(jìn)行優(yōu)化和評價[26]。本研究采用響應(yīng)面實驗進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化，與優(yōu)化前相比，菌株FS-4抑菌直徑增加了26.1%。不同發(fā)酵條件對菌株發(fā)酵液抑菌活性有一定影響。本研究得到菌株FS-4最優(yōu)發(fā)酵條件為：蛋白胨0.5%，蔗糖2.4%，時間62 h，發(fā)酵溫度28?℃，發(fā)酵pH為7，磷酸氫二鉀、氯化鈉和硫酸鎂為0.05%。這與莫坤聯(lián)[27]從抗香蕉枯萎病菌放線菌BWL58及BWL15-4菌株的最優(yōu)發(fā)酵條件存在一定差異，其原因可能是不同菌株對于發(fā)酵過程中各理化因素需求不同的表現(xiàn)，也可能是生理代謝途徑因菌種差異的體現(xiàn)。

微生物發(fā)酵是個動態(tài)的生物學(xué)過程，培養(yǎng)基中各養(yǎng)分含量、pH、容氧量和產(chǎn)物量一直處于不斷變化，不同因素的變化會對發(fā)酵產(chǎn)物的種類和產(chǎn)量均有較大的影響[27]。本研究僅考慮了發(fā)酵前的培養(yǎng)基狀態(tài)和培養(yǎng)條件，未對發(fā)酵過程各因素進(jìn)行動態(tài)監(jiān)控，在后續(xù)的研究中，應(yīng)采用生物化學(xué)分子生物學(xué)等方法對目標(biāo)菌株的代謝動態(tài)過程進(jìn)行深入研究，探討培養(yǎng)基的各養(yǎng)分含量與目標(biāo)活性物質(zhì)產(chǎn)量及培養(yǎng)條件之間的關(guān)系，進(jìn)而提高目標(biāo)活性物質(zhì)的產(chǎn)率。

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