蘇群 楊亞涵 田敏 卜朝陽 毛立彥 張進(jìn)忠 潘介春 盧家仕

摘? 要：利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對從國內(nèi)外引種的46份睡蓮種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，并對其中的原生種及原生變種構(gòu)建DNA指紋圖譜，旨在闡明其親緣關(guān)系基礎(chǔ)上，為睡蓮分類鑒定、雜交育種、功能基因的挖掘和利用及圖位克隆等提供理論依據(jù)。結(jié)果表明：從100條ISSR引物中篩選出10條多態(tài)性高、重復(fù)性好的引物，在46份睡蓮種質(zhì)資源中共擴(kuò)增出281條帶，平均每條引物擴(kuò)增條帶數(shù)為28.1條，多態(tài)性條帶281條，多態(tài)性比例為100%;平均Shannon信息指數(shù)（I）為0.4197，平均Neis基因多樣性指數(shù)（H）為0.2657，平均有效等位基因數(shù)（N）1.4139，表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性;遺傳相似系數(shù)值在0.51～0.98之間，基于遺傳相似系數(shù)建立了聚類樹狀圖，揭示了46份睡蓮種質(zhì)資源的親緣關(guān)系，并在相似系數(shù)水平為0.68時(shí)，可將所有供試材料聚為6類。對總計(jì)24個(gè)睡蓮原生種及原生變種構(gòu)建了DNA指紋圖譜，依據(jù)圖譜差異可鑒定不同的睡蓮種質(zhì)。

關(guān)鍵詞：睡蓮種質(zhì)資源;ISSR分子標(biāo)記;遺傳多樣性;DNA指紋圖譜

中圖分類號：Q949.746.1????? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Abstract： The genetic diversity of 46 waterlily germplasm resources introduced within China and abroad was analyzed by the ISSR molecular marker technology， and the DNA fingerprints of the original species and varieties were constructed in order to clarify the genetic relationship and provide a theoretical basis for the classification and identification of waterlily， hybrid breeding and functional gene mining， utilization and map-based cloning. The results showed that 10 primers with high polymorphism and good repeatability were screened out from 100 ISSR primers. A total of 281 bands were amplified from 46 waterlily germplasm resources， with an average of 28.1 bands per primer， 281 polymorphic bands and 100% polymorphic ratio. The average Shannon information index （I） was 0.4197， the average Nei's gene diversity index （H） was 0.2657， and the average effective allele number （N） was 1.4139， which showed abundant genetic diversity. The genetic similarity coefficient was between 0.51 and 0.98. Based on the genetic similarity coefficient， a clustering tree was constructed to reveal the genetic relationship of the 46 waterlily germplasm resources. When the similarity coefficient was 0.68， all the tested materials could be clustered into six groups. DNA fingerprints were constructed for 24 original species and varieties of waterlily， and different waterlily germplasms could be identified according to the differences of DNA fingerprints.

Keywords： waterlily germplasm resources; ISSR molecular markers; genetic analysis; DNA fingerprintings

睡蓮為睡蓮科（Nymphaeaceae）睡蓮屬（Nymphaea L.）多年生草本宿根花卉。全世界睡蓮屬植物有50余種，主要分布在熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)[1]。我國有5種[2]，也有的報(bào)道是4種[3]。睡蓮屬可分為5個(gè)亞屬：廣熱帶睡蓮亞屬（Brachyceras）、廣溫帶睡蓮亞屬（Nymphaea）、古熱帶睡蓮亞屬（Lotos）、新熱帶睡蓮亞屬（Hydrocallis）及澳大利亞睡蓮亞屬（Anecphya）[4]。作為水生花卉中的名貴花卉，睡蓮以其豐富的花色、圣潔的寓意及莖葉對水中富營養(yǎng)物和有害物質(zhì)的強(qiáng)吸附能力，深受人們的喜愛。此外，睡蓮花朵可泡茶，葉柄和花柄可食用，全草宜作綠肥，又可入藥，具有極高的食用價(jià)值和觀賞旅游、水景造景價(jià)值[5]。

睡蓮種質(zhì)資源是發(fā)展睡蓮鮮切花、食用生產(chǎn)的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是睡蓮研究領(lǐng)域尤其是睡蓮新品種選育和生物技術(shù)研究的基礎(chǔ)。我國對睡蓮的研究雖處于起步階段，但發(fā)展迅猛，現(xiàn)階段對睡蓮的研究主要集中在引種栽培[6-11]，生殖繁育[12-13]、功能活性[14-17]、生理生化分析[18-20]以及新品種選育[21-23]等方面。對睡蓮種質(zhì)資源遺傳多樣性和分子圖譜的研究則少有報(bào)道，因此，開展睡蓮種質(zhì)資源的遺傳性狀分析和DNA指紋圖譜構(gòu)建，有利于充分利用睡蓮種質(zhì)資源和發(fā)掘、創(chuàng)制出性狀優(yōu)異的睡蓮新種質(zhì)，對睡蓮育種研究和創(chuàng)新具有十分重要的意義。

ISSR（Inter-Simple Sequence Repeat）分子標(biāo)記技術(shù)是一種基于PCR的新興DNA分子標(biāo)記技術(shù)。與其他分子標(biāo)記相比，ISSR分子標(biāo)記具有很大的優(yōu)越性，如試驗(yàn)操作簡單、成本低、快速靈敏、穩(wěn)定性高、所需DNA量少等，而且不需要預(yù)先知道研究對象的基因組序列，大大減少了多態(tài)性分析的預(yù)備工作[24-25]。近年來，ISSR分子標(biāo)記在其他花卉，如杜鵑[26]、荷花[27]、櫻花[28]、桂花[29]、風(fēng)信子[30]及百合[31]等種質(zhì)資源的鑒定與遺傳多樣性分析中得到了廣泛應(yīng)用。此外，ISSR分子標(biāo)記技術(shù)在構(gòu)建遺傳圖譜和指紋圖譜尤其是背景種質(zhì)狹窄的指紋圖譜具有很大潛力[32]。本研究基于ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對從國內(nèi)外引種的46份睡蓮種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，并對其中的原生種及原生變種構(gòu)建DNA指紋圖譜，旨在闡明其親緣關(guān)系基礎(chǔ)上，為睡蓮分類鑒定，雜交育種及功能基因的挖掘、利用，圖位克隆等提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

本研究以46份睡蓮種質(zhì)為實(shí)驗(yàn)材料，其中含有原生種21個(gè)，原生變種3個(gè)，園藝品種22個(gè)。供試樣本均種植于廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所睡蓮種質(zhì)資源圃。采摘完整的、無病蟲害、未展開的沉水幼葉1～2片，浸沒于裝有純凈水的標(biāo)記袋中4?℃冰箱保存，樣本順序及編號見表1。

1.2? 方法

1.2.1? DNA提取及檢測? DNA提取采用TIANGEN新型植物基因組DNA提取試劑盒，在1%的瓊脂糖凝膠中電泳檢測DNA質(zhì)量，用Gene Spec核酸檢測儀檢測DNA純度和濃度。最后將樣品濃度稀釋為50 ng/μL，–20?℃保存。

1.2.2? ISSR-PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系及程序? 采用20?μL的反應(yīng)體系，包含了2×Es Taq Master Mix（含染料）10 μL，供試睡蓮模板DNA及ISSR引物各1 μL，8 μL的ddH2O補(bǔ)齊。PCR擴(kuò)增程序參考Poczai等[33] 的方法并進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化，具體為：94?℃預(yù)變性1 min;94?℃變性45 s，不同溫度下退火45 s，72 ℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán); 72?℃延伸5 min，4?℃保存?ISSR-PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1.8%的瓊脂糖凝膠電泳，緩沖液為1TAE。

1.2.3? ISSR引物合成及篩選? 根據(jù)加拿大哥倫比亞大學(xué)設(shè)計(jì)并公布的ISSR引物序列，由上海生物工程有限公司合成本實(shí)驗(yàn)需用的100條ISSR引物。預(yù)先用5個(gè)不同睡蓮亞屬供試樣本進(jìn)行初篩，最后選取10條重復(fù)性好、條帶清晰、多態(tài)性高的引物用于本實(shí)驗(yàn)。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)ISSR圖譜條帶的有無，利用人工方法統(tǒng)計(jì)讀帶，將圖譜中穩(wěn)定出現(xiàn)且肉眼可見的電泳條帶賦值為“1”，同一擴(kuò)增水平位置無電泳條帶賦值為“0”，將讀帶數(shù)據(jù)輸入Excel表格，建立原始矩陣數(shù)據(jù)庫，統(tǒng)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶總數(shù)和多態(tài)性條帶數(shù)。用POPGEN 1.32軟件計(jì)算多態(tài)位點(diǎn)百分率、Neis基因多樣性指數(shù)（H）、有效等位基因數(shù)（Ne）和Shannon多樣性信息指數(shù)（I）。用軟件NTSYS 2.10e計(jì)算遺傳相似系數(shù)GS（genetic similarity），根據(jù)GS值按非加權(quán)配對算術(shù)平均法（UPMGA）進(jìn)行聚類分析，建立聚類圖。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 引物擴(kuò)增多態(tài)性及遺傳多樣性分析

2.1.1? 引物擴(kuò)增多態(tài)性分析? 采用試劑盒提取的46份睡蓮基因組DNA電泳結(jié)果見圖1。10條ISSR引物在46份睡蓮種質(zhì)資源中共擴(kuò)增出281條譜帶，其中281條均具有多態(tài)性，占100%（表2）。單條引物擴(kuò)增出的清晰條帶數(shù)在23～35條之間，擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)最多引物為UBC835，擴(kuò)增出35個(gè)位點(diǎn)，最少為UBC845，有23個(gè)位點(diǎn)，平均多態(tài)性條帶28.1條?？梢奍SSR檢測睡蓮屬種質(zhì)資源遺傳多樣性的效率很高，也表明睡蓮屬種質(zhì)資源在分子水平上具有極為豐富的遺傳多樣性。引物UBC?841對46份睡蓮種質(zhì)基因組DNA的擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示。

2.1.2? 遺傳多樣性分析? 等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Shannon多樣性信息指數(shù)（I）和Nei's基因多樣性指數(shù)（H）均是衡量遺傳多樣性水平的常用指標(biāo)，是目前應(yīng)用較為廣泛的遺傳多樣性指數(shù)。46份睡蓮種質(zhì)資源的平均Na、Ne、H和I值分別為2.000、1.4139、0.2657和0.4197（表3）。

2.2? 睡蓮種質(zhì)資源的ISSR聚類分析

2.2.1? 遺傳相似系數(shù)? 利用10個(gè)引物產(chǎn)生的標(biāo)記信息，建立了供試樣本的相似系數(shù)矩陣。遺傳相似系數(shù)值越大，說明材料間的親緣關(guān)系越近，反之，親緣關(guān)系越遠(yuǎn)。46份睡蓮種質(zhì)資源的遺傳相似系數(shù)在0.51～0.98之間，平均遺傳相似系數(shù)為0.78。其中24號的白藍(lán)星與43號藍(lán)星種質(zhì)之間的遺傳相似系數(shù)最大為0.98，說明他們之間的親緣關(guān)系最近，遺傳差異相對較小。7號的秘魯睡蓮與35號的紫色幻想之間的遺傳相似系數(shù)最小為0.51，說明他們之間的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，遺傳差異相對較大。

2.2.2? 聚類分析? 為了確定各供試材料間的遺傳關(guān)系，通過軟件NTSYS 2.10e對46份睡蓮種質(zhì)資源計(jì)算遺傳相似系數(shù)GS（genetic similarity），根據(jù)GS值按非加權(quán)配對算術(shù)平均法（UPMGA）進(jìn)行聚類分析，建立遺傳關(guān)系聚類圖（圖3）。由圖3可知，供試材料以遺傳相似系數(shù)0.68為閾值時(shí)，可將46份睡蓮種質(zhì)資源聚為6類，第I類由屬于廣溫帶亞屬的12份睡蓮種質(zhì)資源組成，其中的12號小白子午蓮單獨(dú)聚成一支;第II類由屬于人工跨亞屬雜交育成的跨亞屬的4份睡蓮種質(zhì)資源組成，具體為35號紫色幻想與41號詩麗吉皇后聚在一起，36號暹羅紫與39號暹羅粉聚在一起。第II類的4個(gè)人工雜交的跨亞屬品種，在遺傳相似系數(shù)0.66時(shí)與第I類的廣溫帶亞屬聚在一起，說明相對于其他亞屬，第II類人工雜交的跨亞屬品種與廣溫帶亞屬親緣關(guān)系較近。這在表觀形態(tài)特征上也能體現(xiàn)，如上述跨亞屬雜交的4個(gè)品種葉片呈橢圓或卵圓型，葉片邊緣全緣，花朵浮于或略高于水面，其均是典型的廣溫帶亞屬睡蓮具有的特征，但其花部特征尤其是雄蕊與廣溫帶亞屬睡蓮差異較大;第III類由屬于廣熱帶亞屬的16份睡蓮種質(zhì)資源組成，其中小花睡蓮、21號暹羅皇后、34號華麗、37號約瑟芬及40號紫喬伊這5份睡蓮種質(zhì)資源聚在一起;第IV類由同屬于澳洲亞屬的4份睡蓮種質(zhì)

圖3? 46份睡蓮種質(zhì)資源基于ISSR的遺傳相似性聚類分析

Fig. 3? Cluster analysis of 46 waterlily germplasm resources based on ISSR genetic identities

資源組成，具體為3號藍(lán)巨睡蓮和42號白巨睡蓮聚在一起，8號變色澳洲睡蓮與13號澳洲IM睡蓮聚在一起;第V類由3種同屬于新熱帶亞屬的睡蓮種質(zhì)組成，其中27號具備花胎生能力的增殖睡蓮單獨(dú)聚為一支;第VI類由同屬于古熱帶亞屬的7份睡蓮種質(zhì)組成，其中19號喀麥隆睡蓮單獨(dú)聚為一支。

2.3? 部分睡蓮種質(zhì)資源的DNA指紋圖譜構(gòu)建

用篩選出的10個(gè)ISSR引物對24個(gè)睡蓮原生

種及變種構(gòu)建DNA指紋圖譜，通過對比發(fā)現(xiàn)引物UBC840和UBC841均可單獨(dú)鑒別出24份睡蓮原生種質(zhì)資源。本研究利用UBC840構(gòu)建了24份睡蓮原生種質(zhì)資源DNA指紋圖譜（圖4），其中黑色表示該位點(diǎn)有條帶，即該位點(diǎn)0-1矩陣中為“1”，無色表示該位點(diǎn)無條帶，即該位點(diǎn)在0-1矩陣中為“0”。構(gòu)建的指紋圖譜可用于24份睡蓮原生種質(zhì)資源的分類與鑒定。

圖4? 基于UBC840分子標(biāo)記構(gòu)建的睡蓮原生種及原生變種的DNA指紋圖譜

Fig. 4? DNA fingerprint of primordial species and varieties of waterlily based on UBC840 molecular markers

3? 討論

3.1? 睡蓮種質(zhì)資源遺傳多樣性及親緣關(guān)系分析

遺傳多樣性是生物所攜帶的遺傳信息總和，是每種生物所固有的特性，一個(gè)種群遺傳多樣性越高或越豐富，在環(huán)境發(fā)生變化時(shí)生存下來的可能性就越大，越容易擴(kuò)展其分布范圍和開拓新環(huán)境[34-35]。ISSR分子標(biāo)記具有擴(kuò)增多態(tài)性高、穩(wěn)定性好、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)[36]，現(xiàn)已被應(yīng)用于熱帶睡蓮的遺傳關(guān)系分析、雜交種鑒定[33]、聚群內(nèi)遺傳變異及基因流分析中[37]。本研究通過反復(fù)試驗(yàn)，得到優(yōu)化后的ISSR-PCR體系，篩選出10個(gè)引物

對46份睡蓮種質(zhì)資源進(jìn)行了擴(kuò)增，多態(tài)性位點(diǎn)百分率高達(dá)100%，Shannon信息指數(shù)（I）為0.4197，有效等位基因數(shù)（Ne）為1.4139，Neis基因多樣性指數(shù)（H）為0.2657，表明睡蓮種質(zhì)資源具有極為豐富的遺傳多樣性，蘊(yùn)涵著廣泛的遺傳變異，這也與張海平[38]通過研究睡蓮的表觀性狀多樣性及同工酶分析得出的結(jié)果一致，同時(shí)也說明ISSR分子標(biāo)記可以較好地用于睡蓮屬的多樣性分析。睡蓮屬植物開花習(xí)性表現(xiàn)為雌蕊先熟（protogyny）[1]，這種性成熟時(shí)間自然隔離特點(diǎn)導(dǎo)致絕大部分睡蓮屬植物為異花授粉，致使睡蓮屬植物種間基因交流頻繁，雜合度和多態(tài)性很高，可能是影響其種間在形態(tài)和分子遺傳特性上的巨大差異的重要原因。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，供試睡蓮屬種質(zhì)資源的遺傳相似系數(shù)為0.51～0.98，豐富的遺傳多樣性為睡蓮雜交親本選擇和育種提供了重要的科學(xué)依據(jù)。從聚類圖上看，在閾值0.78時(shí)，很多睡蓮屬種質(zhì)資源單獨(dú)聚成一支，說明其與同亞屬的其他睡蓮種質(zhì)資源差異較大，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，而且很多均是育性非常好的原生種質(zhì)資源，如12號小白子午蓮，32號米奴塔等，其育種潛力還未被完全開發(fā)，可作為亞屬內(nèi)或跨亞屬雜交時(shí)的優(yōu)良親本選擇。

睡蓮屬下分類現(xiàn)今依舊沒有非常明確的標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)生態(tài)學(xué)特征，通常將睡蓮分為耐寒睡蓮（hardy waterlily）和熱帶睡蓮（tropical waterlily）2大類[1]，根據(jù)心皮的離生或聚合以及花柱的有無可將睡蓮屬植物分為2大組5個(gè)亞組[1， 9]，根據(jù)地理來源可將睡蓮屬分為5或6個(gè)亞屬[4， 39]，即將睡蓮屬分為：廣溫帶亞屬、廣熱帶亞屬、古熱帶亞屬、新熱帶亞屬及澳洲亞屬，后4個(gè)亞屬通常簡單稱為熱帶睡蓮。本研究以遺傳相似系數(shù)GS值按非加權(quán)配對算術(shù)平均法（UPMGA）進(jìn)行聚類分析，建立了46份睡蓮種質(zhì)資源的遺傳關(guān)系聚類圖，從聚類圖上看，全部耐寒睡蓮聚在一起構(gòu)成單系類群，這與張海平[38]基于形態(tài)性狀的聚類分析和劉艷玲等[40]基于ITS的睡蓮屬系統(tǒng)分類的研究一致，但熱帶睡蓮分類地位與他們有較大出入。王海平[38]和劉艷玲等[40]認(rèn)為，熱帶睡蓮聚在一起構(gòu)成單系類群，在其內(nèi)部分成2支，一支是印度藍(lán)睡蓮、藍(lán)星睡蓮等晝開夜閉型睡蓮，另一支則由印度紅睡蓮、埃及白睡蓮為代表的古熱帶亞屬組成的夜開晝閉型睡蓮。本研究顯示古熱帶亞屬單獨(dú)聚為一支，且位于聚類圖基部，支持黃國振等[1]提出的認(rèn)為晚上開花類型是比較原始的，相當(dāng)于塔氏圖示的第2階段，白天開花類型相當(dāng)于第4階段，耐寒睡蓮類型相當(dāng)于第5、第6階段的觀點(diǎn)。此外從聚類圖上看部分地理來源相同的睡蓮種質(zhì)資源聚在一起，如第IV類供試材料全部來源于澳洲，歸屬于澳洲睡蓮亞屬，具有較近的親緣關(guān)系，支持根據(jù)地理來源的將睡蓮屬分為5個(gè)亞屬的分類方式。

從聚類圖上看，在閾值約為0.69時(shí)，可將第III類廣熱帶亞屬分為2支。其一支由9份非胎生能力的睡蓮種質(zhì)組成，另一支是由7份睡蓮屬種質(zhì)聚在一起，其中5份具有胎生能力的睡蓮種質(zhì)聚在一起，說明具有胎生能力的睡蓮種質(zhì)遺傳關(guān)系較近，表明它們很可能具有共同的起源。2份非胎生能力的睡蓮種質(zhì)分別是11號黃金國和23號蘇皖娜，黃金國俗稱黃色九品香水蓮，是臺灣園林部門在引種美國睡蓮基礎(chǔ)上培育而成[41-42]，蘇皖娜是由泰國著名睡蓮育種家N. Nopchai Chansilpa博士選育出的著名灑金睡蓮名品，這2個(gè)品種親本來源復(fù)雜，之所以與具胎生能力睡蓮種質(zhì)聚為一支，很可能是其親本中混有胎生能力的親本祖先，致使其親緣關(guān)系更靠近于具胎生能力的睡蓮種質(zhì)。

3.2? 睡蓮屬原生種質(zhì)資源分子指紋圖譜

目前，我國在花卉品種資源生產(chǎn)和經(jīng)營方面尚不規(guī)范，品種引種混亂或品種造假的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，因此，開展花卉品種資源鑒定顯得尤為重要[43]。傳統(tǒng)的花卉品種資源鑒定方法主要依靠表型特征，雖然快速便捷，但是表型性狀受環(huán)境影響較大，鑒別錯(cuò)誤率較高，加之花卉品種資源逐年擴(kuò)大，品種的相似度也越來越高，導(dǎo)致通過傳統(tǒng)的表型鑒定方法越來越難[43]。DNA指紋圖譜是指DNA樣品用特定分子標(biāo)記技術(shù)處理顯示出具有特定DNA片段的總稱[44]。DNA遺傳物質(zhì)由于受環(huán)境影響較小、多態(tài)性高，基于DNA擴(kuò)增的PCR技術(shù)已經(jīng)成為花卉品種鑒定最有效的方法[42， 45-46]。絕大部分睡蓮原生種及其變種在未開花前非常相似，很難辨別，如藍(lán)星和白藍(lán)星，其葉型、葉色都極為相似，需開花后才可區(qū)分。少部分在開花條件下也很難區(qū)分開，如埃及白睡蓮及其變種柔毛齒葉白睡蓮，花色均為純白色，鋸齒狀葉片，單從表觀形態(tài)上很難區(qū)分開來，本研究通過篩選出的10個(gè)ISSR引物對24個(gè)睡蓮原生種及原生變種構(gòu)建DNA指紋圖譜。分子身份證構(gòu)建的目的是準(zhǔn)確、快速和便捷地鑒別出不同種質(zhì)的遺傳信息，因此，在進(jìn)行分子身份構(gòu)建時(shí)，不僅要求標(biāo)記位點(diǎn)的多態(tài)性要豐富，而且檢測方法要操作簡便、重復(fù)性強(qiáng)[47]。通過對比發(fā)現(xiàn)引物UBC840和UBC841均可單獨(dú)鑒別出24份睡蓮原生種質(zhì)資源。本研究基于引物UBC840構(gòu)建了24份供試睡蓮原生種質(zhì)的DNA指紋圖譜，該圖譜可作為相應(yīng)睡蓮原生種質(zhì)資源鑒定和分類的依據(jù)，同時(shí)也為新種質(zhì)和新品種的分類鑒定及知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)提供分子技術(shù)水平上的保障。

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