王維娜，趙春蘭2，梁月勉，王曄興，張文清

(1.河北大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，河北 保定 071000；2.保定市婦幼醫(yī)院病理科，河北 保定 071000)

Nupr1是最初在急性胰腺炎中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)小分子應(yīng)激核蛋白[1]，后來(lái)發(fā)現(xiàn)它與多種腫瘤發(fā)生及進(jìn)展有關(guān)。關(guān)于它在乳腺癌中的作用研究很少，本研究檢測(cè)了乳腺癌組織(實(shí)驗(yàn)組)及乳腺良性病變組織(對(duì)照組)Nupr1 mRNA及蛋白表達(dá)情況，并分析了其與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系，探討Nupr1表達(dá)與乳腺癌發(fā)生、進(jìn)展、預(yù)后的關(guān)系，以期為臨床個(gè)體化治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

隨機(jī)選取2012年1月至2018年12月河北大學(xué)附屬醫(yī)院乳腺科術(shù)前未接受治療的手術(shù)切除228例乳腺癌(包括非特殊型浸潤(rùn)性癌161例，特殊型浸潤(rùn)性癌67例)及60例良性乳腺病變(對(duì)照組)，常規(guī)石蠟包埋備免疫組化檢測(cè)。留取上述病例中部分行術(shù)中冰凍送檢的新鮮組織(包括乳腺癌30例，良性乳腺病變41例，不典型導(dǎo)管增生19例)，組織離體后盡快置于-80 ℃液氮冷凍并低溫冰箱保存?zhèn)鋗RNA檢測(cè)用。患者均為女性，年齡22～70歲，中位年齡52歲。由2名資深病理醫(yī)師復(fù)閱切片確診。本研究經(jīng)河北大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化檢測(cè)

免疫組化S-P檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)公司，染色步驟按說(shuō)明書進(jìn)行。Nupr1兔抗人多克隆抗體購(gòu)自上?？泼羯锟萍加邢薰?。其余抗體(ER、PR、HER-2、Ki67)購(gòu)自福州邁新公司，0.01%PBS代替一抗作陰性對(duì)照。HER-2的判定參照《乳腺癌HER2檢測(cè)指南》[2]。Nupr1判定標(biāo)準(zhǔn)：高倍鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中著色細(xì)胞百分比，取5個(gè)視野的平均值。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：陰性為0分、陽(yáng)性細(xì)胞≤10%為1分、11%～50%為2分、51%～75%為3分、>75%為4分。染色強(qiáng)度：無(wú)染色為0分、淡黃色為1分、棕黃色為2分、深棕色為3分。兩得分相乘，以總分4分為分界點(diǎn)，將<4分者定義為Nupr1陰性，≥4分者為Nupr1陽(yáng)性[3]。其余免疫組化參照2012版WHO乳腺癌組織學(xué)與分子遺傳學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)。分子分型參照2018年乳腺癌診療指南。由2位病理醫(yī)師盲法觀察，記數(shù)10個(gè)高倍視野染色豐富區(qū)200個(gè)癌細(xì)胞中著色細(xì)胞數(shù)，計(jì)算著色細(xì)胞比例，取平均值。

1.2.2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)

總RNA提取用Trizol、RT-PCR試劑盒均購(gòu)自武漢博士德公司。RT-PCR引物由上海生物工程有限公司合成。mRNA檢測(cè)標(biāo)本取自術(shù)后新鮮組織，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書提取總RNA。取2 μg總RNA，加入oligoDT、逆轉(zhuǎn)錄酶，25 ℃ 5 min→42 ℃ 10 min→50 ℃ 60 min→70 ℃ 5 min進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。Nupr1(211 bp)引物序列：5′-GCG GGC ACG AGA GGA AAC-3′; 5′-CTC AGT CAG CGG GAA TAA GTC-3′; GAPDH作為內(nèi)參標(biāo)，引物(121 bp)序列：5′-GGC GGC ACC ACC ATG TAC CCT -3′; 5′-AGG GGC CGG ACT CGT CAT ACT -3′。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 2 μL，加入引物各0.5 μL、SYBR GREEN MAsterMix10 μL置 iQTM SYBR Green Supermix上 (Bio-Rad, Her-cules, CA) 。PCR循環(huán)參數(shù)95 ℃ 30 s→60 ℃ 30 s→72 ℃ 30 s，共循環(huán)40個(gè)周期,72 ℃ 4 min 延伸。樣本均設(shè)3個(gè)平行對(duì)照以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 Nupr1 mRNA的表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR溶解曲線分析證實(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物具有特異性。乳腺癌、不典型導(dǎo)管增生、良性乳腺病變3組間mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為3.25±0.46、2.23±0.50、0.08±0.31，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=18.324，P<0.05)，其中乳腺癌及不典型導(dǎo)管增生組中 Nupr1 mRNA表達(dá)均高于良性乳腺病變組(t=2.613，P<0.05；t=6.339，P<0.05)。

2.2 Nupr1蛋白在不同組中的表達(dá)

Nupr1蛋白在乳腺癌中顯示胞漿、胞核著棕黃色顆粒(圖1)，免疫組化結(jié)果顯示乳腺癌組Nupr1蛋白高表達(dá)率53.5%，部分乳腺癌顯示陰性表達(dá)(圖2)，乳腺良性病變組Nupr1蛋白高表達(dá)率16.7%。乳腺癌組中Nupr1蛋白表達(dá)高于乳腺良性病變組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=25.969，P<0.0001)。

2.3 Nupr1蛋白在不同組織學(xué)類型乳腺癌中的表達(dá)

非特殊型浸潤(rùn)性癌Nupr1蛋白高表達(dá)率53.4%,特殊型浸潤(rùn)性癌(包括浸潤(rùn)性小葉癌、浸潤(rùn)性微乳頭狀癌、腺樣囊性癌)Nupr1蛋白高表達(dá)率53.7%,非特殊型浸潤(rùn)性癌與特殊型浸潤(rùn)性癌Nupr1蛋白高表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Nupr1的表達(dá)與組織學(xué)類型無(wú)關(guān)(χ2=0.002，P=0.964)。

圖1 乳腺癌組織中Nupr1呈核/漿強(qiáng)陽(yáng)性著色(免疫組化S-P法，40×10)

圖2 部分乳腺癌組織中Nupr1陰性(免疫組化S-P法，40×10)

2.4 Nupr1蛋白表達(dá)與乳腺癌分期的關(guān)系

Ⅰ期、Ⅱ期及Ⅲ期乳腺癌Nupr1蛋白高表達(dá)率分別為28.6%、52.8%、85.15%。Nupr1蛋白高表達(dá)與乳腺癌分期有關(guān)(χ2=33.970,P<0.0001)，隨著腫瘤分期的進(jìn)展，Nupr1蛋白表達(dá)有逐漸增高的趨勢(shì)，其中Ⅲ期乳腺癌Nupr1蛋白高表達(dá)率高于Ⅰ期(χ2=32.900，P<0.0001)及Ⅱ期(χ2=15.790，P<0.0001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Ⅱ期乳腺癌Nupr1蛋白高表達(dá)率高于Ⅰ期(χ2=9.160，P=0.002)。

2.5 Nupr1蛋白表達(dá)與不同分子分型的關(guān)系

Luminal A型、Luminal B型、三陰性型及HER-2型乳腺癌Nupr1蛋白高表達(dá)率分別為47.7%、44.4%、51.4%、75.6%。不同的分子分型Nupr1蛋白高表達(dá)率不同(χ2=14.367，P<0.001)。其中三陰性型、Luminal A、B型Nupr1蛋白高表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.360，P=0.834)，HER-2型Nupr1蛋白表達(dá)率高于Luminal A型、Luminal B型、三陰性型，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.703，P=0.001；χ2=6.801，P=0.009；χ2=8.851，P=0.003)。

2.6 Nupr1蛋白表達(dá)與乳腺癌腫瘤大小、組織學(xué)分級(jí)、月經(jīng)狀態(tài)的關(guān)系

Nupr1蛋白表達(dá)與乳腺癌患者月經(jīng)狀態(tài)無(wú)關(guān)。腫瘤大小以2.0 cm為界， Nupr1蛋白表達(dá)與乳腺癌腫瘤大小無(wú)關(guān)。參照Nottingham聯(lián)合組織學(xué)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)乳腺癌進(jìn)行組織學(xué)分級(jí)， Nupr1蛋白表達(dá)與乳腺癌組織學(xué)分級(jí)無(wú)關(guān)(表1)。

表1 Nupr1蛋白表達(dá)與乳腺癌腫瘤大小、組織學(xué)分級(jí)、月經(jīng)狀態(tài)的關(guān)系

3 討論

Nupr1作為一廣泛分布于體內(nèi)的應(yīng)激誘導(dǎo)蛋白，首次在大鼠急性胰腺炎腺泡細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)。人類Nupr1基因編碼相對(duì)分子量約8×103的小分子核蛋白，故被命名為P8。Nupr1具有轉(zhuǎn)錄活性，通過(guò)參與不同的胞內(nèi)信號(hào)途徑發(fā)揮不同的功能。非腫瘤性病變中，可發(fā)揮抗炎、自噬等作用。且已證實(shí)它在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程起重要作用[4-8]。包括在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的促進(jìn)作用，其機(jī)制可能與蛋白激酶A路徑保護(hù)細(xì)胞免受代謝應(yīng)激誘導(dǎo)的自噬性死亡、抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。下調(diào)胰腺癌細(xì)胞中Nupr1的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞線粒體功能異常,引起程序介導(dǎo)的細(xì)胞壞死；另外在口腔鱗狀細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌、胃癌、肝細(xì)胞癌、甲狀腺乳頭狀癌中均顯示高表達(dá)，且與患者年齡、腫瘤進(jìn)展、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度有關(guān)[9-11]。Zeng等[12]發(fā)現(xiàn)抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞Nupr1的表達(dá)可通過(guò)改變Caspase蛋白及PTEN的狀態(tài)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。以上研究均支持Nupr1在腫瘤發(fā)生進(jìn)展中起促進(jìn)作用。另一種觀點(diǎn)認(rèn)為Nupr1在某些腫瘤中也可能作為腫瘤生長(zhǎng)抑制因子發(fā)揮作用，這似乎與先前的文獻(xiàn)報(bào)道矛盾，但可能Nupr1的獨(dú)特之處就在于其具備復(fù)雜的生物學(xué)功能,包括前列腺癌、膀胱癌細(xì)胞中Nupr1表達(dá)均低于正常組織，且它的表達(dá)水平與腫瘤的浸潤(rùn)及增殖能力呈負(fù)相關(guān)[13-14]。有研究者認(rèn)為Nupr1作為一種內(nèi)在無(wú)序蛋白，與細(xì)胞內(nèi)一些復(fù)合物結(jié)合后，可以誘導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)停止和衰老, 減少細(xì)胞遷移, 減少化學(xué)耐藥,并成功地阻止了裸鼠體內(nèi)腫瘤的進(jìn)展，提示它可能作為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)[15]。Jia等[16]也發(fā)現(xiàn)惡性黑色素瘤細(xì)胞中，下調(diào)Nupr1的表達(dá)，可通過(guò)P53基因的途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增生，同樣推測(cè)Nupr1為潛在的腫瘤抑制基因。

在乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)Nupr1的表達(dá)情況不盡一致。Ree等[5]研究發(fā)現(xiàn)，Nupr1可以在人類乳腺癌發(fā)展的早期發(fā)揮促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的作用，且與乳腺癌轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良相關(guān)，這提示Nupr1可能是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)的關(guān)鍵蛋白。Jung等[17]發(fā)現(xiàn)早期乳腺癌細(xì)胞系中染色體16p11.2及17q12循環(huán)區(qū)改變與腫瘤預(yù)后不良有關(guān)，二者共同陽(yáng)性的腫瘤預(yù)后更差，而Nupr1基因定位于16p11.2，HER-2定位于17q12，推測(cè)基因拷貝數(shù)的異常改變參與了腫瘤的轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)，HER-2型乳腺癌Nupr1表達(dá)水平明顯高于其他分子類型乳腺癌，可能與此變化有關(guān)。Jiang等[18]卻發(fā)現(xiàn)預(yù)后差的乳腺癌中Nupr1表達(dá)降低，且發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤比無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的Nupr1表達(dá)水平低，ER-beta陽(yáng)性且低水平表達(dá)Nupr1的腫瘤生存期短，推測(cè)Nupr1在乳腺癌細(xì)胞中的作用與在膀胱癌、前列腺癌中的作用類似，可能起腫瘤抑制基因的作用并參與雌激素調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)，其中Nupr1可能受雌激素和泛素通路雙重調(diào)節(jié)。而Ito等[11]發(fā)現(xiàn)Nupr1的表達(dá)與乳腺癌細(xì)胞凋亡指數(shù)呈負(fù)相關(guān)。

基因表達(dá)的調(diào)控體現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、翻譯調(diào)控及翻譯后調(diào)控，本研究發(fā)現(xiàn)，Nupr1 mRNA在乳腺癌組織顯著高于不典型導(dǎo)管增生及良性乳腺組織，且與蛋白表達(dá)一致，提示了此基因在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中起了重要作用。Nupr1蛋白在乳腺導(dǎo)管原位癌及癌前病變中高表達(dá)率高于乳腺良性病變，這與某些研究[17]結(jié)果一致，推測(cè)它在乳腺癌的早期發(fā)生階段發(fā)揮了重要作用，其作用機(jī)制可能與它在胰腺癌早期階段有相似之處。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺浸潤(rùn)性癌中Nupr1的高表達(dá)率與腫瘤分期有關(guān)，腫瘤的分期越晚，Nupr1高表達(dá)率越高。

不同分子分型的乳腺癌中，一般認(rèn)為L(zhǎng)uminal型乳腺癌患者發(fā)病年齡晚、組織學(xué)分級(jí)低、無(wú)病生存期長(zhǎng)、預(yù)后好，而HER-2型和三陰性型恰好相反[2]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)預(yù)后相對(duì)不良的HER-2型，Nupr1的表達(dá)顯著高于預(yù)后較好的Luminal型；而三陰性型Nupr1表達(dá)未見顯著升高。這些結(jié)果均表明，乳腺癌的晚期進(jìn)展中，Nupr1有可能起了重要的作用，且Nupr1高表達(dá)與乳腺癌的預(yù)后不良有關(guān)。

上述研究結(jié)果表明，Nupr1可能在乳腺癌早期階段即發(fā)生了改變，包括基因?qū)W表達(dá)的改變，通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制發(fā)揮促腫瘤作用。檢測(cè)組織中Nupr1的表達(dá)，探討其與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)機(jī)制的關(guān)系可以從嶄新的角度明確乳腺癌發(fā)生的機(jī)制，檢測(cè)Nupr1的表達(dá)水平可能作為乳腺癌早期發(fā)現(xiàn)、判斷預(yù)后及采用個(gè)體化治療方案的有用指標(biāo)。同時(shí)提示Nupr1基因沉默可能是治療乳腺癌的一種很有前途的靶點(diǎn)，需要進(jìn)一步深入研究。