李慶成 黃 磊 李亞洲 范超蘭 謝 蝶 趙來賓 張舒潔 陳雪姣 甯順腙 袁中偉 張連全 劉登才 郝 明

小麥-黑麥6RS/6AL易位染色體的遺傳穩(wěn)定性及其在配子中的傳遞

李慶成**黃 磊**李亞洲 范超蘭 謝 蝶 趙來賓 張舒潔 陳雪姣 甯順腙 袁中偉 張連全 劉登才 郝 明*

四川農(nóng)業(yè)大學小麥研究所, 四川成都 611130

小麥-黑麥6RS/6AL易位系HM812-41攜帶抗白粉病基因。為評價其育種利用潛力, 以HM812-41為親本分別與推廣品種蜀麥580、蜀麥830和蜀麥969雜交, 雜種F1與中國春進行正反交, 研究6RS/6AL易位染色體在不同背景中的遺傳穩(wěn)定性及其通過雌雄配子的傳遞規(guī)律。同時, 利用“雙頂交”法改良易位系的綜合農(nóng)藝性狀?；蚪M原位雜交結(jié)果表明, 6RS/6AL易位染色體在傳遞過程中結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。6RS/6AL易位染色體可以高頻率地通過雌、雄配子傳遞, 其傳遞率分別為45.05%~53.33%和43.94%~53.04%。初步分析“雙頂交”F2分離群體表明, 6RS/6AL易位染色體對主要農(nóng)藝性狀如株高、穗長、小穗數(shù)和自交結(jié)實率沒有明顯的不利影響。用“雙頂交”法可以快速地改良易位系的綜合農(nóng)藝性狀。

小麥; 黑麥; 白粉病; 6RS/6AL易位; 配子傳遞率; 遺傳穩(wěn)定性

小麥近緣屬種蘊藏著大量抗病蟲、耐逆、優(yōu)質(zhì)、豐產(chǎn)等基因。通過遠緣雜交和染色體工程技術(shù), 將外源優(yōu)良基因?qū)? 可以拓寬小麥育種的遺傳基礎(chǔ)。小麥-黑麥1RS/1BL易位是應(yīng)用外源基因育種最為成功的例子。1RS/1BL易位系同時攜帶抗小麥葉銹病()、稈銹病()、條銹病()和白粉病基因()。同時, 在一些遺傳背景下, 該易位系還能增加根系的生物量[1-2]。突出的抗病、抗逆能力促進了1RS/1BL易位在全球范圍內(nèi)的廣泛應(yīng)用。除此之外, 偃麥草[3-4]、簇毛麥[5-6]、冰草[7-8]等物種的實踐應(yīng)用, 對我國小麥遺傳育種工作發(fā)展也起到了極大的促進作用。

小麥-外源附加系、代換系和易位系是小麥導入外源基因的主要形式。其中, 臂間易位是外源優(yōu)異基因利用的重要形式, 而小片段易位攜帶的外源染色體片段小, 被認為是育種利用的最佳形式。相比于小片段易位, 小麥-外源臂間易位創(chuàng)制簡單、高效。因此, 臂間易位仍然是目前導入外源基因的重要形式。導入的外源染色體臂對缺失小麥染色體臂的遺傳補償性、易位染色體本身的遺傳穩(wěn)定性、傳遞率及其是否連鎖嚴重不利農(nóng)藝性狀是影響其育種應(yīng)用的關(guān)鍵[9-11]。以我國自主創(chuàng)制和成功應(yīng)用的6VS/6AL易位為例, 李桂萍等[10]發(fā)現(xiàn), 雖然小麥-簇毛麥6VS/6AL易位染色體在不同小麥背景下, 通過雄配子的傳遞率均低于通過雌配子的傳遞率, 但兩者的傳遞率均接近50%的理論值(雌配子49.2%; 雄配子44.7%)。不僅如此, 除攜帶強抗白粉病基因, 6VS/6AL對穗長和粒重還有正向效應(yīng)[12-13]。這些因素可能是6VS/6AL成功應(yīng)用于我國小麥品種選育的重要基礎(chǔ)。

黑麥(L., RR)表現(xiàn)出良好的抗病、抗逆特征, 含豐富的白粉病抗性基因[14]。黑麥染色體1R、2R、4R、5R、6R均含有白粉病抗性基因[15-21]。其中, 正式命名的有5個, 分別是位于1RS染色體臂的和[15,17,19]、2R染色體長臂上的[16]、6R染色體長臂的[16]和短臂的[21]。是最近被發(fā)現(xiàn)和命名的一個源于黑麥的抗白粉病基因, 來源于中國黑麥地方品種秦嶺黑麥。Hao等[21]利用6R(6A)雙單體, 誘導著絲?！皵嗔?融合”, 獲得含的6RS/6AL純合易位系。為更好地利用6RS染色體臂所攜帶的抗白粉病基因, 本研究用6RS/6AL純合易位系HM812-41與不同小麥品種雜交、測交, 通過分子標記和原位雜交鑒定, 分析6RS/6AL染色體在不同小麥背景中的遺傳穩(wěn)定性及其通過雌、雄配子的傳遞規(guī)律。同時, HM812-41的遺傳背景來自地方品種開縣羅漢麥和中國春, 綜合農(nóng)藝性狀差。利用分子標記技術(shù)檢測F2分離群體, 評價6RS/6AL易位對主要農(nóng)藝性狀的影響, 同時改良易位系的遺傳背景。

1 材料與方法

1.1 植物材料

小麥-黑麥6RS/6AL純合易位系HM812-41, 普通小麥品種(系)WJL5606、WJL3931、D-2-3-4、中國春(CS)、蜀麥580、蜀麥830、蜀麥969、蜀麥80、蜀麥126; 2個“雙頂交”(double-top cross, DTC) F2群體[22](蜀麥969/HM812-41//WJL5606/3/蜀麥80和蜀麥969/HM812-41//WJL5606/3/蜀麥921)用于溫室白粉病鑒定; “雙頂交”F2群體蜀麥969/HM812-41//蜀麥830/3/WJL3931和蜀麥969/HM812-41//WJL 5606/ 3/蜀麥126, 種植于四川農(nóng)業(yè)大學成都校區(qū)惠和基地, 用于農(nóng)藝性狀調(diào)查。分離群體由四川農(nóng)業(yè)大學小麥研究所創(chuàng)制, 其他由四川農(nóng)業(yè)大學小麥研究所選育或保存。

1.2 花粉活力鑒定

采用I2-KI染色法鑒定花粉活力。具體操作方法與劉英華等[23]一致。試驗分3個不同日期取樣, 作為重復。

1.3 易位染色體的雌、雄配子傳遞分析

純合易位系HM812-41在開花前人工去雄, 2~3 d后, 分別用蜀麥580、蜀麥830和蜀麥969的花粉進行授粉, 獲得雜種F1。為研究易位染色體通過雌、雄配子的傳遞率, 將雜種F1分別做父、母本與中國春測交; 測交F1種子于室內(nèi)發(fā)芽, 分單株移栽至塑料盆后置溫室生長。在移栽前, 剪取植株的根尖用于細胞學鑒定。用CTAB法[24]提取苗期葉片基因組DNA, 用于后續(xù)的分子標記鑒定。正、反測交F1后代中, 含外源易位染色體的植株占總植株的百分數(shù)即為易位染色體通過相應(yīng)配子的傳遞率。

1.4 分子標記鑒定

含抗白粉病基因的6RS染色體區(qū)段特異分子標記為KU.962, 目的條帶大小約為400 bp[21]。該標記為顯性標記, 對應(yīng)引物由成都擎科生物技術(shù)有限公司合成(http://www.tsingke.net/)。PCR體系20 μL, 含10 μL 2×PCR Mix、1 μL引物(正、反引物各0.5 μL, 濃度為10 μmol L–1)、1 μL模板DNA (約100 ng μL–1)和8 μL ddH2O。擴增程序為95℃初始變性5 min; 然后95℃變性30 s, 60℃退火30 s, 72℃延伸, 35個循環(huán); 最后72℃延伸10 min[25]。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測, UVP凝膠成像系統(tǒng)成像。

1.5 原位雜交鑒定

以生物素標記的秦嶺黑麥基因組DNA為探針, 以高溫蒸汽打斷的中國春基因組DNA為封組, 進行基因組熒光原位雜交(Genomehybridization, GISH)檢測6RS染色體。普通小麥和黑麥通用著絲粒探針6C6[26], 黑麥著絲粒探針pAWRC.1[27]用于檢測易位染色體的著絲粒組成。分別以節(jié)節(jié)麥AS60和秦嶺黑麥基因組DNA為模板PCR擴增, 瓊脂糖凝膠電泳回收目標條帶后, 用缺口平移法, 以地高辛和生物素標記為熒光探針。按Hao等[28]的流程進行原位雜交。

1.6 白粉病抗性鑒定

溫室的培養(yǎng)條件為16 h光照/22℃和8 h黑暗/16℃, 濕度70%。待鑒定材料中間混種誘發(fā)材料為SY95-71。于三葉期, 收集誘發(fā)材料上自然發(fā)病的混合白粉菌孢子, 抖落在待鑒定植株上, 每15 d記錄一次葉片和葉鞘的抗病表現(xiàn), 直到成熟期。將抗病反應(yīng)分為抗病(無可見病斑和白粉菌孢子堆)和感病(有病斑或孢子堆) 2種[12]。

1.7 農(nóng)藝性狀調(diào)察

在成熟期調(diào)察株高、穗長、小穗數(shù)和自交結(jié)實率。株高為植株最高處(不包括芒)距地面高度; 穗長為穗基部距頂部(不包括芒)長度; 僅用各發(fā)育小穗基部2朵小花統(tǒng)計自交結(jié)實率。自交結(jié)實率 = (結(jié)實種子數(shù)/小花總數(shù))×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 6RS/6AL易位染色體著絲粒組成

利用小麥-黑麥通用著絲粒探針6C6和黑麥著絲粒特異探針pAWRC.1檢測6RS/6AL易位染色體(圖1)。原位雜交結(jié)果顯示, 該易位染色體的著絲粒區(qū)域同時具有兩個探針的雜交信號, 表明小麥和黑麥均對其著絲粒的形成具有貢獻。

2.2 雜合狀態(tài)下6RS/6AL易位染色體的傳遞率及結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性

以小麥品種蜀麥580、蜀麥830和蜀麥969為母本, 易位系為父本雜交, 獲得6RS/6AL和6A雙單體雜種F1, 再分別與中國春正反交, 獲得測交雜種F1。以是否含有6RS特異分子標記KU.962的目標條帶判斷是否存在6RS/6AL易位染色體, 從而推斷6RS/6AL通過雌雄配子的傳遞率。如表1所示, 6RS/6AL在3個不同遺傳背景中, 通過雌配子的傳遞率分別為45.05%、53.33%和48.00%, 經(jīng)χ2檢驗, 與理論值(50%)無顯著差異(值分別為0.35、0.47和0.73); 通過雄配子的傳遞率分別為46.24%、53.04%和43.94%, 與理論值也無顯著差異(值分別為0.47、0.51和0.32)。雖然涉及蜀麥969的雜交組合中, 6RS/6AL通過雌配子的傳遞率略高于通過雄配子, 但統(tǒng)計檢驗差異并不顯著(= 0.75); 另外2個組合的雌、雄配子傳遞能力沒有差異。

圖1 6RS/6AL易位系的染色體著絲粒

A: 易位系HM812-41的42條染色體。B: 探針6C6檢測的易位系HM812-41著絲粒。C: 探針pAWRC.1的易位系HM812-41著絲粒。D: B和C的整合。箭頭指易位染色體6RS/6AL的著絲粒。

A: 42 chromosomes of the translocation line HM812-41; B: centromeres of the translocation line HM812-41 detected by the probe 6C6; C: centromeres of the translocation line HM812-41 detected by the probe pAWRC.1; D: merging of B and C. Arrows show the centromeres of the translocated chromosome 6RS/6AL.

為判斷6RS/6AL易位染色體在傳遞過程中的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性, 隨機選取了41個上述含有KU.962特異分子標記的植株(蜀麥580/HM812-41//CS 15株、蜀麥830/HM812-41//CS 15株、蜀麥969/HM812-41//CS 11株)進行基因組原位雜交鑒定。所有41個植株均含單條完整的6RS/6AL易位染色體, 表明6RS/6AL易位染色體在雜交過程中結(jié)構(gòu)穩(wěn)定, KU.962特異分子標記可以用于追蹤6RS/6AL易位染色體。

2.3 6RS/6AL易位染色體白粉病抗性穩(wěn)定性

蜀麥580、蜀麥830和蜀麥969在溫室感白粉病, HM812-41在溫室抗白粉病, 它們之間的雜種F1抗白粉病, 表明6RS/6AL攜帶的能穩(wěn)定表達白粉病抗性。為進一步評價在不同遺傳背景下的抗病穩(wěn)定性, 隨機選取蜀麥969/HM812-41// WJL5606/3/蜀麥80 F2組合的16個單株和蜀麥969/ HM812-41//WJL5606/3/蜀麥921 F2組合的23個單株, 種植于溫室進行白粉病抗性鑒定。利用KU.962檢測是否含有6RS/6AL易位染色體。結(jié)果表明, 所有含KU.962目標條帶的單株(分別為10和14株)均抗白粉病, 表明在不同遺傳背景下具有穩(wěn)定的白粉病抗性。同時, 不含有目標條帶的單株(分別為6株和9株)表現(xiàn)出抗病或者感病, 表明所涉及的小麥品種(系)可能含有其他的白粉病抗性基因。

表1 6RS/6AL易位染色體在小麥背景中通過雌雄配子的傳遞率

2.4 6RS/6AL易位染色體對農(nóng)藝性狀的影響

利用I2-KI花粉染色法, 調(diào)查易位系HM812-41的花粉活性。根據(jù)I2-KI染色成藍黑色的花粉比例推測, 易位系的平均花粉活力為94.1%, 與普通小麥中國春(93.0%)和D-2-3-4 (95.2%)差異均不顯著(檢驗,值分別為0.31和0.32)。但是, 易位系HM812-41綜合農(nóng)藝性狀差, 植株高(2018年, 田間平均株高為137.2 cm; 同期種植的審定品種蜀麥580、蜀麥830和蜀麥969平均分別為84.2、83.2和89.9 cm)。

為評價6RS/6AL易位染色體對農(nóng)藝性狀的影響,利用“雙頂交”法, 結(jié)合分子標記輔助選擇, 獲得蜀麥969/HM812-41//蜀麥830/3/WJL3931 F2(簡稱Pop.1; 115株)和蜀麥969/HM812-41//WJL5606/3/蜀麥126 F2(簡稱Pop.2; 107株) 2個分離群體, 這些群體單株理論上只含有12.5%的易位系血緣(圖2-A)。田間觀察表明, 降低易位系的血緣, 能快速地改良易位系的農(nóng)藝性狀(圖2-B)。依據(jù)KU.962分子標記的有無, 將2個群體分別劃分成含6RS/6AL的亞群體(Pop.1+, 72株; Pop.2+, 76株)和不含6RS/6AL的亞群體(Pop.1–, 43株; Pop.2–, 31株)。比較2個群體各自亞群體間的株高、穗長、小穗數(shù)和結(jié)實率差異, 判斷6RS/6AL易位染色體的影響。在Pop.2群體中, 含6RS/6AL易位染色體單株的平均結(jié)實率(92.6%)極顯著高于不含易位染色體單株的平均自交結(jié)實率(85.7%)(兩尾-test,= 0.005)。但是, 其余性狀在兩個群體各自亞群體間沒有差異(圖3)。

圖2 6RS/6AL易位系的改良流程和植株表現(xiàn)

A: 6RS/6AL易位系的改良流程; B: 田間植株表現(xiàn)。從左至右的單株分別為: 易位系HM812-41、蜀麥580、蜀麥830、蜀麥969、蜀麥969/HM812-41 F1、蜀麥969/HM812-41//蜀麥830 F1、蜀麥969/HM812-41//蜀麥830/3/WJL3931 F1和蜀麥969/HM812-41//蜀麥830/3/WJL3931 F2。

A: Crossing diagram for improving 6RS/6AL translocation line; B: the progenies’ performance. The plants from left to right are the translocation line HM812-41, Shumai 580, Shumai 830, Shumai 969, Shumai 969/HM812-41 F1, Shumai 969/HM812-41//Shumai 830 F1, Shumai 969/HM812-41//Shumai 830/3/WJL3931 F1, and Shumai 969/HM812-41//Shumai 830/3/WJL3931 F2, respectively.

圖3 兩個“雙頂交”F2分離群體的主要農(nóng)藝性狀表現(xiàn)

A: 株高; B: 穗長; C: 小穗數(shù); D: 自交結(jié)實率。Pop.1+和Pop.1–分別表示含和不含6RS/6AL易位染色體的蜀麥969/HM812-41//蜀麥830/3/WJL3931 F2亞群體; Pop.2+和Pop.2–分別表示含和不含6RS/6AL易位染色體的蜀麥969/HM812-41//WJL5606/3/蜀麥126 F2亞群體。**: 表示含(+)與不含(–)6RS/6AL易位染色體亞群體間差異極顯著(兩尾-test,< 0.01)。

A: plant height; B: spike length; C: spikelet number; D: seed set ratio. Pop.1+ and Pop.1–, represent sub-population with and without 6RS/6AL translocation from Shumai 969/HM812-41//Shumai 830/3/WJL3931 F2population, respectively. Pop.2+ and Pop.2–, represent subpopulation with and without 6RS/6AL translocation from Shumai 969/HM812-41//WJL5606/3/Shumai 126 F2population. **: significantly difference between sub-populations with and without 6RS/6AL translocation (two-way-test,< 0.01).

3 討論

外源染色體在小麥背景中的穩(wěn)定性和傳遞率是影響其利用的關(guān)鍵因素之一。本研究通過分子標記對易位系HM812-41與不同品種雜種F1和中國春的測交F1分離群體鑒定表明, 6RS/6AL易位染色體能夠正常地通過雌雄配子傳遞, 傳遞頻率與理論值(50%)無顯著差異, 且雌雄配子間無顯著差異。我們前期也發(fā)現(xiàn), 在6R與6A雙單體自交過程中, 6R的傳遞率高[自交傳遞率為(116/158)×100%=73.4%; 未發(fā)表數(shù)據(jù)]。張文俊等[29]在研究黑麥6R染色體在小麥背景中的傳遞時, 發(fā)現(xiàn)6R在6R(6D)代換系中, 通過雌、雄配子的傳遞頻率只有8.8%和10.3%, 傳遞頻率較低。這種傳遞率的差異可能與6R染色體的來源以及缺失的小麥染色體有關(guān)。利用揚麥18 (6VS/6AL易位系)和揚麥22 (6VS/6DL易位系)構(gòu)建的高代重組自交系, Zhao等[13]發(fā)現(xiàn), 6VS/6AL易位染色體的傳遞率顯著高于6VS/6DL。表明小麥6D染色體(臂)的缺失本身也可能影響配子的傳遞率, 而6R (或6RS)和6V(或6VS)本身對配子傳遞率無明顯影響?；蚪M原位雜交鑒定表明, 本研究中所有經(jīng)檢測的含特異分子標記測交植株均含有一條完整6RS/6AL易位。綜合上述結(jié)果表明, 在雜交過程中, 該易位系既可做母本, 也可做父本, 具有很大的靈活性, 且基本可排除易位染色體重新斷裂的潛在不利影響。

小麥-黑麥6RS/6AL易位染色體穩(wěn)定表達白粉病抗性, 且對主要農(nóng)藝性狀沒有明顯的不利影響, 是抗白粉病小麥育種的重要抗源。許多外源導入系的遺傳背景較差, 育種家利用的積極性不高。前期, 本課題組對綜合農(nóng)藝性狀差的人工合成小麥, 采用“雙頂交”法成功進行了育種改良, 已選育審定了3個品種[22]。本研究中, 我們采取同樣的策略改良6RS/6AL易位系HM812-41, 雖然目前僅得到F2代的材料, 但改良材料表現(xiàn)出良好的綜合農(nóng)藝性狀。因此, 有必要對該育種方法進一步擴大利用, 改良小麥育種原始材料, 推動小麥遺傳改良工作。

4 結(jié)論

小麥-黑麥6RS/6AL易位染色體在不同小麥背景穩(wěn)定表達白粉病抗性, 且雜交過程中通過雌雄配子傳遞率高, 染色體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定, 是抗白粉病育種的重要資源?！半p頂交”法在改良綜合農(nóng)藝性狀差的材料中具有重要潛力, 值得進一步推廣應(yīng)用。

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Genetic stability of wheat-rye 6RS/6AL translocation chromosome and its transmission through gametes

LI Qing-Cheng**, HUANG Lei**, LI Ya-Zhou, FAN Chao-Lan, XIE Die, ZHAO Lai-Bin, ZHANG Shu-Jie, CHEN Xue-Jiao, NING Shun-Zong, YUAN Zhong-Wei, ZHAN Lian-Quan, LIU Deng-Cai, and HAO Ming*

Triticeae Research Institute, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, Sichuan, China

The wheat-rye 6RS/6AL translocation line HM812-41 harbors the powdery mildew resistance gene. In order to evaluate the potential utilization in breeding, the translocation line was crossed to common wheat varieties Shumai 580, Shumai 830, and Shumai 969. The F1hybrids were then reciprocally crossed with Chinese spring to estimate the genetic stability of 6RS/6AL and its transmission rate through male and female gametes in different genetic backgrounds. Double-top crossing (DTC) strategy was used to improve the agronomic traits of the translocation line. Genomehybridization analysis indicated that the 6RS/6AL translocation was very stable during transmission. The 6RS/6AL translocation was transmitted to offsprings with a high frequency, which was 45.05%–53.33% for female gametes and 43.94%–53.04% for male gametes. Based on the agronomical performances of DTC F2populations, we found that the 6RS/6AL translocation was not linked to obvious defects for major agronomic traits, such as plant height, spike length, spikelet number and seed-setting ratio in selfing. The agronomic traits of the translocation line can be obviously improved through DTC strategy.

wheat; rye (); powdery mildew; 6RS/6AL translocation; gamete transmission; genetic stability

2019-08-07;

2019-12-26;

2020-01-16.

10.3724/SP.J.1006.2020.91051

郝明, E-mail: haomingluo@foxmail.com, Tel: 028-82650313

**同等貢獻(Contributed equally to this work)

李慶成, E-mail: 1808654030@qq.com; 黃磊, E-mail: 1129559183@qq.com

本研究由四川省教育廳重點項目(16ZA0028)和四川省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)研究面上項目(2019YJ0415)資助。

This study was supported by the Key Projects of Sichuan Provincial Department of Education (16ZA0028) and the Applied Basic Research Programs of Science & Technology Department of Sichuan Province (2019YJ0415).

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20200115.1349.025.html