梁思維 姜昊梁 翟立紅 萬小榮 李小琴 蔣 鋒,* 孫 偉,*

玉米HD-ZIP I亞家族基因鑒定及表達(dá)分析

梁思維1姜昊梁1翟立紅2萬小榮1李小琴1蔣 鋒1,*孫 偉1,*

1仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院, 廣東廣州 510225;2湖北文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院, 湖北襄陽 441053

轉(zhuǎn)錄因子是植物響應(yīng)逆境脅迫的重要調(diào)節(jié)因子, 在其整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用。HD-ZIP家族蛋白是植物中特有的一大類轉(zhuǎn)錄因子, 包含4個(gè)亞家族(HD-ZIP I~IV), 其中HD-ZIP I亞家族成員主要參與干旱、滲透壓等極端環(huán)境和ABA及乙烯等激素處理的響應(yīng)過程。本文采用隱馬可夫模型(HMM)在玉米參考基因組中鑒定到17個(gè)HD-ZIP I亞家族成員, 這些基因不均勻分布于玉米6條染色體上, 與水稻的親緣關(guān)系要近于擬南芥。玉米HD- ZIP I 亞家族基因在玉米7種組織中表現(xiàn)出多種表達(dá)模式, 具有明顯的組織表達(dá)特異性。另外, HD-ZIP I亞家族基因?qū)Ω啕}、淹水及冷害等不同的逆境脅迫處理呈現(xiàn)出不同的響應(yīng)模式及響應(yīng)程度差異。5種不同激素處理后, 玉米HD-ZIP I亞家族基因也表現(xiàn)出復(fù)雜的響應(yīng)模式。這些結(jié)果為進(jìn)一步解析玉米HD-ZIP I亞家族基因的生物學(xué)功能和作用機(jī)理提供了一定的參考價(jià)值。

HD-ZIP I 亞家族; 逆境脅迫; 表達(dá)分析; 玉米

植物生長(zhǎng)發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜且多樣的生物學(xué)過程,這一發(fā)育過程常受到多種生物及非生物等脅迫因素的影響。在應(yīng)對(duì)這些脅迫中, 植物啟動(dòng)了細(xì)胞、分子以及生理生化水平等多種調(diào)節(jié)機(jī)制[1-2]。植物最早感知和傳遞的非生物逆境脅迫信號(hào)是通過信號(hào)分子途徑, 然后影響一系列相關(guān)基因的表達(dá)水平[3]。其中, 轉(zhuǎn)錄因子在植物應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。目前已有研究表明, 脅迫響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子的誘導(dǎo)表達(dá), 如、、、和[4-7], 會(huì)提高植株對(duì)逆境脅迫的適應(yīng)能力, 越來越多的證據(jù)表明, HD-ZIP家族蛋白參與植物對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)[8]。

HD-ZIP家族蛋白是植物中特有的一大類轉(zhuǎn)錄因子, 在擬南芥、水稻、小麥、大麥、馬鈴薯、向日葵、番茄和苜蓿中均有報(bào)道[9-17]。HD-ZIP蛋白包括兩個(gè)重要的功能域, 即DNA結(jié)合的HD功能域(domain)和與之緊密相連、與蛋白二聚化作用相關(guān)的ZIP功能域[18]。擬南芥基因組中共存在48個(gè)HD-ZIP家族蛋白[9,19], 并根據(jù)DNA結(jié)合特異性、理化功能特性和其他的功能域?qū)⑺鼈兎殖?個(gè)亞家族(HD-ZIP I ~ HD-ZIP IV)[18-19], 與植物響應(yīng)相關(guān)的HD-ZIP蛋白大多屬于第I亞類, 這一亞類家族成員的表達(dá)水平主要受干旱、滲透壓等極端環(huán)境和ABA及乙烯等激素的影響[20]。研究表明, 在干旱和冷害脅迫條件下, HD-ZIP I家族基因AtHB6、AtHB7 、AtHB12、SlHB2和GhHB1通過氣孔關(guān)閉、增加水分吸收和一系列應(yīng)激相關(guān)基因的調(diào)控等途徑來增強(qiáng)植物的耐受性, 減輕脅迫導(dǎo)致的不良反應(yīng)[21-23], 而苜蓿MtHB1通過調(diào)節(jié)根的表面積來適應(yīng)高鹽脅迫[11]。水稻OsHOX22會(huì)影響ABA的生物合成, 并能通過ABA介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑來調(diào)控干旱和高鹽脅迫響應(yīng)過程[24]。向日葵基因受到干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá), 進(jìn)而促進(jìn)水楊酸(JA)和乙烯(Eth)的產(chǎn)生, 從而提高植物對(duì)干旱脅迫的適應(yīng)[14,25]。冷害脅迫下, 向日葵HaHB11和擬南芥AtHB13能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和抑制冰生成的蛋白質(zhì), 從而增強(qiáng)擬南芥對(duì)低溫脅迫的抵抗能力[26-27]。此外, HD-ZIP I 亞家族基因作為轉(zhuǎn)錄因子, 其作用的發(fā)揮依賴于上下游基因的調(diào)控。研究表明,在黑暗條件下上調(diào)表達(dá), 在鹽脅迫和低溫冷害脅迫下表達(dá)量下降[19]。研究表明, 在短日照條件下, PIF1能夠誘導(dǎo)的表達(dá), 表明AtHB1在PIF1的下游發(fā)揮作用, 促進(jìn)下胚軸的伸長(zhǎng)[28]。AtHB1與基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合, 導(dǎo)致鐵供給條件下基因表達(dá)降低[29]。AtHB1通過與()啟動(dòng)子結(jié)合參與擬南芥抵抗高溫、高鹽和干旱脅迫響應(yīng)過程[30]。另外, 水稻OsHOX4能夠與的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合, 參與水稻赤霉素(GA)信號(hào)傳導(dǎo)和干旱脅迫反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)過程[31-32]。總之, HD-ZIP I亞家族蛋白在植物應(yīng)對(duì)非生物逆境脅迫過程中發(fā)揮著重要的作用。

目前, 盡管模式植物中的HD-ZIP I家族部分成員已經(jīng)有所報(bào)道, 參與非生物逆境脅迫響應(yīng)和激素調(diào)節(jié)過程, 玉米和基因在擬南芥和水稻中過量表達(dá)會(huì)降低這些植物對(duì)干旱和鹽脅迫的敏感性, 也增強(qiáng)玉米對(duì)干旱及鹽脅迫的耐受性[33-34], 但是關(guān)于玉米HD-ZIP I亞家族蛋白的研究相對(duì)較少。本文將進(jìn)一步展開對(duì)玉米HD-ZIP I亞家族成員的系統(tǒng)研究, 闡明該亞家族基因在逆境脅迫和激素處理下的表達(dá)變化規(guī)律, 為進(jìn)一步解析玉米HD-ZIP I亞家族基因的生物學(xué)功能和作用機(jī)制提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料種植與處理

將玉米測(cè)序自交系B73種子在室溫下水浸4 h后播于32盆沙缽中, 于溫室培養(yǎng)至二葉一心期, 每盆留下長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗5~6株。玉米幼苗經(jīng)100 μmol L–1脫落酸(ABA)、赤霉素(GA3)、萘乙酸(NAA)、激動(dòng)素(KT)和乙烯(Eth)等激素處理以及漬害脅迫、高鹽脅迫和冷害脅迫, 共8種處理, 每種處理2盆, 處理4 h, 2盆做空白對(duì)照。激素處理是用葉面噴施; 漬害脅迫是將水淹沒至玉米幼苗的第1片葉片處; 高鹽處理是用0.2 mol L–1的NaCl溶液; 冷害處理是在低溫光照培養(yǎng)箱(10℃)中進(jìn)行; 冷害后恢復(fù)處理是在冷害脅迫4 h后再將玉米幼苗恢復(fù)至室溫環(huán)境培養(yǎng)。

1.2 玉米HD-ZIP I亞類基因鑒定與分析

根據(jù)TAIR (The Arabidopsis Information Resource, http://www.arabidopsis.org/)網(wǎng)站提供的擬南芥HD- ZIP I亞類基因的氨基酸序列, 采用隱馬可夫模型(HMM)在MaizeGDB (http://www.maizegdb.org/)中檢索。利用該家族亞類的結(jié)構(gòu)特點(diǎn), 通過BLASTp對(duì)蛋白功能結(jié)構(gòu)域HD和ZIP進(jìn)行檢索, 篩選HD-ZIP I亞類蛋白。進(jìn)一步根據(jù)MaizeGDB上查找的基因信息(B73 RefGen_V3), 將基因標(biāo)注于玉米10條染色體上,并利用在線分析工具GSDS[35](http://gsds.cbi.pku. edu.cn/)和SMART[36](http://smart.emblheidelberg.de/)繪制基因蛋白結(jié)構(gòu)圖, 再根據(jù)分析得到的HD和ZIP結(jié)構(gòu)域位置信息, 完善基因蛋白結(jié)構(gòu)圖, 對(duì)個(gè)別顯示錯(cuò)誤的結(jié)構(gòu)圖進(jìn)行手工修正。

1.3 植物中HD-ZIP I亞類基因同源性分析

系統(tǒng)進(jìn)化樹分析所用HD-ZIP I 亞類蛋白質(zhì)序列, 玉米的來自MaizeGDB (http://maizegdb.org/)、水稻的來自TIGR (http://www.tigr.org/)和擬南芥的來自TAIR (http://www.arabidopsis.org/)。采用Clustal X 2.0軟件[37]進(jìn)行HD-ZIP I亞類蛋白的多重序列比對(duì)和Neighbor- Joining進(jìn)化樹的構(gòu)建, 并用MEGA software version 5.1[38]展示其結(jié)果。Bootstrap分析采用1000次重復(fù)。

1.4 玉米HD-ZIP I 表達(dá)分析

將脅迫和激素處理后的玉米幼苗分別在液氮中研磨至粉末狀, 參照試劑盒說明書, 加入適量的Tripure Isolation Reagent (Promega, USA)進(jìn)行總RNA的提取。用RNase-free DNase預(yù)處理所有樣品提取的總RNA, 分別選取1 μg用M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit (TaKaRa, Japan)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。在Bio- Rad CFX96 Real-time System進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增。使用iTaq Universal SYBR Green Supermix (Bio- Rad, USA)試劑盒并按其提供的方法, 擴(kuò)增體系為25 μL。反應(yīng)程序?yàn)?4℃ 3 min, 94℃ 10 s, 58℃ 30 s, 共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品以肌動(dòng)蛋白(,)為內(nèi)參, 重復(fù)3次, 結(jié)果用2–DDCt進(jìn)行相對(duì)定量分析[39]。選用PRIMER 5設(shè)計(jì)所有引物, 且橫跨一個(gè)內(nèi)含子(附表1)。

文中所用該亞類基因表達(dá)數(shù)據(jù)來自玉米表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)qTeller (http://qteller.com/qteller3/), 選取幼苗的地下部分(Seedling_roots)、地上部分(Seedling_shoots)、完全展開葉片(Leaves)、幼嫩的雌穗(Tassels)、幼嫩的雄穗(Ears)和授粉后5 d/10 d的籽粒(Seeds_5DAP、Seeds_10DAP)等7個(gè)組織的表達(dá)量數(shù)據(jù), 運(yùn)用R軟件(R version 3.1.2) gplots包中heatmap.2制作heatmap圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米HD-ZIP I亞家族基因的鑒定

根據(jù)HD-ZIP家族蛋白的HD和ZIP兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的特點(diǎn), 基于HMM模型在玉米基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索, 共篩選到55個(gè)符合該家族基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的多肽序列。其中, 17個(gè)多肽序列僅含有HD和ZIP兩個(gè)結(jié)構(gòu)域, 不含其他已知序列結(jié)構(gòu)(或功能域), 屬于HD-ZIP I亞家族(表1), 參考MaizeGDB Gene Data (https://www.maizegdb.org/gene_center/gene)命名所有基因。將17個(gè)基因序列與玉米基因組比對(duì), 發(fā)現(xiàn)這些基因分布于玉米6條染色體上(圖1), 即1號(hào)、2號(hào)、4號(hào)、5號(hào)、7號(hào)和9號(hào)染色體。其中, 有6個(gè)基因位于1號(hào)染色體上, 4個(gè)基因位于2號(hào)染色體上, 另外在4號(hào)、7號(hào)和9號(hào)染色體上分別存在2個(gè)基因, 在5號(hào)染色體僅有1個(gè)基因。這些基因在DNA序列長(zhǎng)度上差異顯著,基因最長(zhǎng), 為4811 bp,基因最短, 僅為1307 bp (表1)。有趣的是, 不同基因所含外顯子數(shù)目基本相同, 除基因有4個(gè)外顯子外, 所有基因均含有2~3個(gè)外顯子(表1和圖2)。這些基因的編碼序列(ORF)長(zhǎng)度差異不大, 在720~1134 bp之間; 翻譯的氨基酸序列長(zhǎng)度相近, 在239~377 aa之間(表1)。由此可見, 造成這些基因DNA序列長(zhǎng)度差異的關(guān)鍵原因不是外顯子的數(shù)目和長(zhǎng)度, 而是內(nèi)含子序列的長(zhǎng)度。

表1 玉米HD-ZIP I亞家族基因信息

圖1 玉米HD-ZIP I亞家族基因在染色體上的分布

2.2 玉米HD-ZIP I亞家族蛋白結(jié)構(gòu)域和系統(tǒng)進(jìn)化分析

進(jìn)一步分析玉米HD-ZIP I亞家族基因結(jié)構(gòu)和蛋白功能結(jié)構(gòu)域, 發(fā)現(xiàn)17個(gè)蛋白中都含有同源異型結(jié)構(gòu)域(HD domain), 屬于Homodomian蛋白(圖2)。在HD的羧基端, 也同樣存在保守的鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域(ZIP domain)(圖2)?？梢? 這些基因具有明顯的HD-ZIP家族的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。除此之外, 沒有分析到其他具有明顯結(jié)構(gòu)的功能域, 這也是HD-ZIP I亞家族蛋白與其他3個(gè)亞家族蛋白在結(jié)構(gòu)上的區(qū)別, 是鑒定HD-ZIP I亞家族基因的依據(jù)之一。

圖2 玉米HD-ZIP I亞家族基因及蛋白結(jié)構(gòu)域分析

左圖中直線表示內(nèi)含子, 黑色長(zhǎng)方形(寬)表示外顯子, 黑色長(zhǎng)方形(窄)表示非編碼調(diào)控區(qū)(untranslated region, UTR); 右圖中黑色圓角矩形表示HD結(jié)構(gòu)域, 黑色橢圓形表示ZIP結(jié)構(gòu)域。

The line indicates intron, wide black rectangle indicates exon, and narrow black rectangle indicates untranslated region (UTR) in left figure; the black round corner rectangle indicates HD domain and black hexagon indicates ZIP domain in right figure.

根據(jù)HD-ZIP I亞家族蛋白的氨基酸序列及其保守性, 玉米、水稻和擬南芥中分別存在17、14和17個(gè)HD-ZIP I亞家族蛋白基因。同時(shí), 利用CLC Sequence Viewer軟件分析并構(gòu)建玉米、水稻和擬南芥該亞家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)。雖然該亞家族基因在單子葉(玉米和水稻)和雙子葉(擬南芥)植物中的數(shù)目差異不大, 但三者在蛋白序列組成和排列上區(qū)別較大。從系統(tǒng)進(jìn)化樹可以看出, 這些基因在玉米和水稻中基本上是成組出現(xiàn), 即1個(gè)水稻基因?qū)?yīng)1個(gè)或2個(gè)玉米基因, 或是1個(gè)玉米基因?qū)?yīng)1個(gè)或2個(gè)水稻基因, 比如與、與和等。這與擬南芥基因存在明顯的區(qū)別, 在不同的分支中, 擬南芥的基因基本上是成簇出現(xiàn), 比如、、和。這些結(jié)果說明, 玉米和水稻基因編碼的蛋白在序列上的相似程度要高于擬南芥。這些基因在系統(tǒng)進(jìn)化上的差異也證實(shí)了玉米和水稻的親緣關(guān)系要近于擬南芥, 同時(shí)也可說明這些基因在單雙子葉植物之間存在功能的分化。

圖3 玉米、水稻和擬南芥HD-ZIP I 亞家族蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

所有HD-ZIP I亞家族基因的蛋白序列均來自于各自的基因組數(shù)據(jù)庫(kù): 玉米來自MaizeGDB (http://maizegdb.org/)、水稻來自TIGR (http://www.tigr.org/)和擬南芥來自TAIR (http://www.arabidopsis.org/)。利用ClustalX 2.0軟件進(jìn)行氨基酸序列的多重比對(duì)并用MEGA 5.1 軟件構(gòu)建Neighbor-Joining進(jìn)化樹(Bootstrap分析采用1000次重復(fù))。黃色背景表示擬南芥基因, 綠色背景表示水稻基因, 紫色背景表示玉米基因。

The HD-ZIP I subfamily protein sequences of maize, rice, andwere obtained from the MaizeGDB (http://maizegdb.org/), TIGR (http://www.tigr.org/), and TAIR (http://www.arabidopsis.org/) databases, respectively. Multiple alignment of amino acid sequences was carried out by ClustalX 2.0 software and Neighbor-Joining evolutionary tree was constructed by MEGA 5.1 (1000 replications of bootstrap test).genes are highlighted in yellow background, rice genes are highlighted in green background, and maize genes are highlighted in purple background.

2.3 玉米HD-ZIP I基因表達(dá)分析

從玉米表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)qTeller中下載的HD-ZIP I亞家族基因轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù), 探究不同基因在幼苗、幼根、成熟葉、雌雄穗和授粉后5 d/10 d的種子等7個(gè)組織中的表達(dá)模式差異。其中,在7個(gè)組織中的FPKM值均為0, 故不予分析。其余16個(gè)基因按照log2(FPKM)值作圖(圖4)表明, 該亞家族各個(gè)基因在不同組織器官中的表達(dá)量存在顯著差異?？傮w而言, 各基因在雌穗(Ear)和授粉后的種子(Seed_DAP)中的表達(dá)量要明顯高于其他各時(shí)期的組織, 說明HD-ZIP I亞家族基因在玉米雌穗發(fā)育過程和授粉后的籽粒發(fā)育早期發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用。在生長(zhǎng)發(fā)育早期的幼苗(seedling)中, 除、、、外, 各基因的表達(dá)量都相對(duì)較低, 說明HD-ZIP I亞家族基因中可能只有部分基因參與玉米幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育過程。在生長(zhǎng)發(fā)育后期, 雌穗中各基因的表達(dá)豐度比雄穗和成熟葉片中的高, 說明該亞家族基因?qū)Υ扑氚l(fā)育的重要性。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn), 雌穗、中高豐度的基因在幼苗中表達(dá)水平相對(duì)較低(圖4), 但是和基因剛好相反, 表達(dá)量是幼苗中高于雌穗中, 說明這些基因的表達(dá)具有一定的組織特異性。在玉米的各個(gè)組織器官中, 均有HD-ZIP I亞家族基因的表達(dá), 說明這些基因可能參與多個(gè)組織器官發(fā)育的調(diào)控, 影響整個(gè)植株的生長(zhǎng)。

圖4 玉米HD-ZIP I亞家族基因表達(dá)譜

Leaves: 完全展開葉; Tassels: 幼嫩的雄穗; Ears: 幼嫩的雌穗: Seedling_shoots: 幼苗地上部分; Seedling_roots: 幼苗地下部分; Seeds_5DAP: 授粉后5 d的籽粒; Seeds_10DAP: 授粉后10 d的籽粒。方框內(nèi)顏色代表HD-ZIP I亞家族基因表達(dá)數(shù)據(jù)的ln的對(duì)數(shù)值(ln (RPKM))。

Leaves: fully expended leaves; Tassels: immature tassels; Ears: immature ears; Seedling_shoots: the shoots of maize seedlings; Seedling_roots: the roots of maize seedlings; Seeds_5DAP: the seeds at 5 days after pollination; Seeds_10DAP: the seeds at 10 days after pollination. Colors in square represent the logarithm of the HD-Zip I subfamily gene expression level (ln (RPKM)).

2.4 玉米HD-ZIP I響應(yīng)脅迫和激素應(yīng)答

對(duì)經(jīng)過高鹽、淹水及冷害等逆境脅迫處理前后的B73玉米幼苗進(jìn)行HD-ZIP I 亞家族基因表達(dá)分析。結(jié)果顯示, HD-ZIP I 亞家族中17個(gè)基因?qū)Σ煌哪婢趁{迫呈現(xiàn)出不同的響應(yīng)模式及響應(yīng)程度差異(圖5),、、、、、和七個(gè)基因受高鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá), 而、和三個(gè)基因的表達(dá)則被顯著抑制。漬害脅迫時(shí), 僅、和三個(gè)基因表達(dá)量明顯升高,、、和四個(gè)基因表達(dá)受到抑制。

冷害脅迫4 h后, 大部分基因的表達(dá)都受到顯著抑制, 僅基因誘導(dǎo)表達(dá)且達(dá)到對(duì)照組的表達(dá)量的2倍以上。對(duì)于冷害脅迫后恢復(fù)室溫4 h時(shí), 除、和三個(gè)基因外, 其他所有基因的表達(dá)量均呈現(xiàn)回升的趨勢(shì): 大部分基因表達(dá)都恢復(fù)到正常表達(dá)水平, 甚至表現(xiàn)出高水平的表達(dá)趨勢(shì)。與冷害處理時(shí)的表達(dá)量相比, 冷害恢復(fù)后、和三個(gè)基因的表達(dá)量雖然有所上升, 但也沒有達(dá)到對(duì)照(無處理)水平, 僅為對(duì)照組表達(dá)量的1/2。另外,、、、、和六個(gè)基因在冷害脅迫后基因的相對(duì)表達(dá)量受到一定程度的抑制, 但是在恢復(fù)至室溫后這6個(gè)基因的表達(dá)量迅速升高, 甚至達(dá)到對(duì)照組的4~10倍。

不同激素處理后, HD-ZIP I亞家族17個(gè)基因表現(xiàn)出復(fù)雜的響應(yīng)模式(圖6)。17個(gè)基因中有9個(gè)在5種激素處理后表現(xiàn)出相同的變化趨勢(shì)。與對(duì)照組相比,基因沒有顯著變化,、和三個(gè)基因表達(dá)量都明顯升高, 而、、、和五個(gè)基因均呈現(xiàn)顯著下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)。另外, 有6個(gè)基因顯著受到一種或多種激素調(diào)控, 包括顯著上調(diào)或顯著下調(diào)。其中,在ABA處理后表達(dá)量上調(diào)了50%,在GA3處理后表達(dá)量增加了接近3倍,的表達(dá)量在除NAA外其他4種激素處理?xiàng)l件下均顯著提高。同時(shí),受NAA誘導(dǎo)下調(diào)表達(dá),在ABA和NAA處理?xiàng)l件下的表達(dá)受到顯著抑制,的豐度在ABA、Eth、GA3和NAA處理后都顯著降低。除此之外,和兩個(gè)基因?qū)τ诓煌に靥幚砗蟊憩F(xiàn)出不同的響應(yīng)特點(diǎn), 它們的表達(dá)均受ABA和KT誘導(dǎo), 受NAA的抑制。

圖5 逆境脅迫下玉米HD-ZIP I亞家族基因的表達(dá)模式

NT: 對(duì)照組; NaCl: 高鹽處理; WL: 漬害脅迫; CT: 冷害脅迫; RCT: 冷害脅迫后恢復(fù)處理?？v坐標(biāo)表示基因的相對(duì)表達(dá)量, 以對(duì)照組(NT)為1, 各基因的不同處理分別與對(duì)照組進(jìn)行比較后獲得的相對(duì)表達(dá)量, 差異顯著性分析采用的是方差分析的方法, *< 0.05、**< 0.01、***< 0.001。

NT: non-treatment; NaCl: NaCl treatment; WL: waterlogging stress; CT: chilling stress; RCT: recuperative treatment after chilling stress. The ordinate indicates the relative expression of genes, using the expression of the non-treatment group (NT) as 1. The significance of difference was evaluated using analysis of variance. *< 0.05, **< 0.01, and ***< 0.001.

圖6 玉米HD-ZIP I 亞家族基因?qū)Σ煌に靥幚淼捻憫?yīng)

MOCK: 對(duì)照組; ABA: 脫落酸; Eth: 乙烯; GA3: 赤霉素; KT: 激動(dòng)素; NAA: 萘乙酸?？v坐標(biāo)表示基因的相對(duì)表達(dá)量, 以對(duì)照組(MOCK)為1, 差異顯著性分析采用的是方差分析的方法, , *< 0.05、**< 0.01、***< 0.001。

MOCK: control; ABA: Abscisic Acid; Eth: Ethylene; GA3: Gibberellin; KT: Kinetin; NAA: 1-naphthylacetic acid. The ordinate represents the relative expression of genes, using the expression of the non-treatment group (MOCK) as 1. The significance of difference was evaluated using analysis of variance. *< 0.05, **< 0.01, and ***< 0.001.

3 討論

同源異型-亮氨酸拉鏈(HD-ZIP) 蛋白是一個(gè)龐大而又保守的基因家族, 是植物所特有的一類轉(zhuǎn)錄因子。在植物中, HD-ZIP蛋白存在于各個(gè)組織和器官中, 它們?cè)诟叩戎参锏纳L(zhǎng)、發(fā)育、形態(tài)建成以及生物和非生物脅迫等逆境應(yīng)答中起著重要的調(diào)控作用[18]。本研究共鑒定到17個(gè)玉米HD-ZIP I亞家族基因, 與模式植物擬南芥(17)和水稻(14)相比[10,13], 三者在數(shù)目上差異不大。但是, 系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)單雙子葉植物在進(jìn)化關(guān)系上還是有一定差異的, 即單子葉植物玉米和水稻中很多旁系同源基因基本是一一對(duì)應(yīng)的, 而雙子葉植物擬南芥在一定程度上是分開進(jìn)化的(圖3)。因此, 這個(gè)結(jié)果在一定程度上解釋了單雙子葉植物在進(jìn)化進(jìn)程中的差別。

另外, 無論是旁系同源基因還是直系同源基因的產(chǎn)生, 在一定程度上會(huì)造成基因功能的分工或是產(chǎn)生全新功能的基因。前人在水稻和擬南芥的HD- ZIP I亞家族基因的研究中很少談及它們?cè)谥参锷L(zhǎng)發(fā)育中不同組織器官中的表達(dá)模式及功能[10,13]。本研究對(duì)玉米HD-ZIP I亞家族基因在7個(gè)組織器官中的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn), 這些基因表現(xiàn)出多種表達(dá)模式。整體來看, 大部分基因在雌穗中有較高的表達(dá), 在授粉后的籽粒中呈現(xiàn)逐漸上升的表達(dá)趨勢(shì), 尤其是授粉后5 d的籽粒中, 比如、和(圖4)。成熟葉片中高水平表達(dá)的、和三個(gè)基因以及幼苗根中高表達(dá)的基因都說明這些基因可能在玉米特定組織器官的建成和發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。在擬南芥中、和與()一起促進(jìn)()的表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)脫落酸的富集, 最終抑制花蕾的發(fā)育[40]。水稻中的同源基因和也被證實(shí)參與水稻花序的發(fā)育過程[41]。研究發(fā)現(xiàn)玉米中僅存在1個(gè)同源基因, 表達(dá)數(shù)據(jù)顯示其僅在雌穗和授粉后的種子中表達(dá)豐度較高, 但其是否具有與擬南芥和水稻相似的生物學(xué)功能還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

大量研究表明, HD-ZIP I亞家族基因表達(dá)受環(huán)境脅迫誘導(dǎo)表達(dá), 主要能夠響應(yīng)干旱、高鹽、ABA和冷害等逆境脅迫[8,10,25,42]。對(duì)經(jīng)過高鹽、淹水及冷害等逆境脅迫處理前后的B73玉米幼苗進(jìn)行HD-ZIP I 亞家族基因表達(dá)分析顯示, HD-ZIP I 亞家族17個(gè)基因可以分成4種響應(yīng)模式, 即基本不響應(yīng)(、、、); 抑制表達(dá)模式(、、、); 誘導(dǎo)表達(dá)模式(、、、、、); 兩種響應(yīng)模式都存在(、、)。整體分析發(fā)現(xiàn), 盡管如此, 在同一響應(yīng)模式下的所有基因?qū)Σ煌哪婢趁{迫的響應(yīng)程度存在一定的差異, 基因表達(dá)量有一定程度的上下浮動(dòng), 但整體變化趨勢(shì)相似。

在擬南芥中, 高濃度的NaCl (100 mmol L–1)處理會(huì)顯著誘導(dǎo)和的表達(dá), 其表達(dá)量上調(diào)12倍和25倍[42]。水稻、和是擬南芥和的同源基因, 干旱脅迫可以誘導(dǎo)這些基因上調(diào)表達(dá), 但它們?cè)谒局械谋磉_(dá)模式不完全相同, 其中突變后可減緩水稻葉片黃化現(xiàn)象[10]。向日葵中的同源基因受高鹽、缺水和ABA誘導(dǎo)表達(dá), 而且過表達(dá)的擬南芥表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐干旱、耐高鹽以及延緩衰老的表型[14,25]。玉米中和的同源基因有4個(gè), 分別是、、和。本研究顯示, 這4個(gè)基因受多種脅迫誘導(dǎo)表達(dá), 其中和在NaCl處理后表達(dá)量上調(diào)幾十倍,和能夠響應(yīng)淹水處理, 表達(dá)量增加2~3倍(圖5)。在冷害脅迫時(shí)這4個(gè)基因的表達(dá)能夠維持基本不變, 在冷害脅迫后恢復(fù)至室溫時(shí)迅速增加。另外, 鹽脅迫也誘導(dǎo)和的表達(dá), 其表達(dá)量上調(diào)2~3倍, 同樣擬南芥中的同源基因、、和也誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。這些結(jié)果表明, 玉米與擬南芥和水稻的同源基因在響應(yīng)逆境脅迫方面有相似的功能。

研究表明, 擬南芥中和也會(huì)受干旱和ABA處理誘導(dǎo)表達(dá)[42]。玉米中的同源基因、和也能夠響應(yīng)ABA誘導(dǎo), 表達(dá)量呈現(xiàn)明顯的上調(diào)趨勢(shì)(圖6)。與擬南芥不同的是, 擬南芥受干旱和ABA誘導(dǎo)表達(dá), 而玉米中的同源基因、和在ABA處理后卻抑制表達(dá)。這些結(jié)果說明不同物種的同源基因?qū)τ谙嗤哪婢趁{迫處理時(shí)的響應(yīng)也是比較復(fù)雜的, 有相似的模式, 也有不同的模式。本研究進(jìn)行的是玉米幼苗的處理, 結(jié)合基因組織表達(dá)分析發(fā)現(xiàn), 與其他基因相比, 這些逆境脅迫響應(yīng)上調(diào)表達(dá)的基因在幼苗的根中的相對(duì)表達(dá)量較高(圖3)。說明這些基因不僅在玉米生長(zhǎng)發(fā)育(尤其是幼苗時(shí)期)過程中發(fā)揮重要作用, 而且也是玉米響應(yīng)逆境脅迫的關(guān)鍵基因。

4 結(jié)論

利用隱馬可夫模型(HMM)在玉米基因組中鑒定到17個(gè)HD-ZIP I亞家族基因, 這些基因不均勻分布于玉米6條染色體上, 與水稻的親緣關(guān)系要近于擬南芥。玉米HD-ZIP I亞家族基因在玉米7種組織中表現(xiàn)出多種表達(dá)模式, 具有明顯的組織表達(dá)特異性。另外, 多種逆境脅迫和激素處理后, 玉米HD- ZIP I亞家族基因表現(xiàn)出復(fù)雜的響應(yīng)模式。

附表1 本文中所用引物序列信息

(續(xù)附表1)

[1] Verslues P E, Agarwal M, Katiyar-Agarwal S, Zhu J, Zhu J K. Methods and concepts in quantifying resistance to drought, salt and freezing, abiotic stresses that affect plant water status.,2006, 45: 523–539.

[2] Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K. Transcriptional regulatory networks in cellular responses and tolerance to dehydration and cold stresses.,2006, 57: 781–803.

[3] Zhu J K. Salt and drought stress signal transduction in plants.,2002, 53: 247–273.

[4] Kim S, Kang J Y, Cho D I, Park J H, Kim S Y. ABF2, an ABRE-binding bZIP factor, is an essential component of glucose signaling and its overexpression affects multiple stress tolerance.,2004, 40: 75–87.

[5] Dai X, Xu Y, Ma Q, Xu W, Wang T, Xue Y, Chong K. Overexpression of an R1R2R3 MYB gene,, increases tolerance to freezing, drought, and salt stress in transgenic.,2007, 143: 1739–1751.

[6] Gao T, Wu Y, Zhang Y, Liu L, Ning Y, Wang D, Tong H, Chen S, Chu C, Xie Q.overexpression greatly improves drought tolerance in transgenic rice.,2011, 76: 145–156.

[7] Hu T, Ye J, Tao P, Li H, Zhang J, Zhang Y, Ye Z. The tomato HD-Zip I transcription factor SlHZ24 modulates ascorbate accumulation through positive regulation of the D-mannose/L-galactose pathway.,2016, 85: 16–29.

[8] Gong S, Ding Y, Hu S, Ding L, Chen Z, Zhu C. The role of HD-Zip class I transcription factors in plant response to abiotic stresses.,2019, doi: 10.1111/ppl.12965.

[9] Mukherjee K, Brocchieri L, Burglin T R. A comprehensive classification and evolutionary analysis of plant homeobox genes.,2009, 26: 2775–2794.

[10] Agalou A, Purwantomo S, Overnas E, Johannesson H, Zhu X, Estiati A, de Kam R J, Engstrom P, Slamet-Loedin I H, Zhu Z, Wang M, Xiong L, Meijer A H, Ouwerkerk P B. A genome-wide survey of HD-Zip genes in rice and analysis of drought-responsive family members.,2008, 66: 87–103.

[11] Ariel F, Diet A, Verdenaud M, Gruber V, Frugier F, Chan R, Crespi M. Environmental regulation of lateral root emergence inrequires the HD-Zip I transcription factor HB1.,2010, 22: 2171–2183.

[12] Lin Z, Hong Y, Yin M, Li C, Zhang K, Grierson D. A tomato HD-Zip homeobox protein, LeHB-1, plays an important role in floral organogenesis and ripening.,2008, 55: 301–310.

[13] Johannesson H, Wang Y, Hanson J, Engstrom P. Thehomeobox geneis a potential regulator of abscisic acid responsiveness in developing seedlings.,2003, 51: 719–729.

[14] Manavella P A, Arce A L, Dezar C A, Bitton F, Renou J P, Crespi M, Chan R L. Cross-talk between ethylene and drought signalling pathways is mediated by the sunflower Hahb-4 transcription factor.,2006, 48: 125–137.

[15] Li W, Dong J, Cao M, Gao X, Wang D, Liu B, Chen Q. Genome-wide identification and characterization of HD-ZIP genes in potato.,2019, 697: 103–117.

[16] Li Y, Xiong H, Cuo D, Wu X, Duan R. Genome-wide characterization and expression profiling of the relation of the HD-Zip gene family to abiotic stress in barley (L.).,2019, 141: 250–258.

[17] Yue H, Shu D, Wang M, Xing G, Zhan H, Du X, Song W, Nie X. Genome-wide identification and expression analysis of the HD-Zip gene family in wheat (L.).(Basel), 2018, 9(2), doi: 10.3390/genes9020070.

[18] Ariel F D, Manavella P A, Dezar C A, Chan R L. The true story of the HD-Zip family.2007, 12: 419–426.

[19] Henriksson E, Olsson A S, Johannesson H, Johansson H, Hanson J, Engstrom P, Soderman E. Homeodomain leucine zipper class I genes in. Expression patterns and phylogenetic relationships.,2005, 139: 509–518.

[20] Romani F, Ribone P A, Capella M, Miguel V N, Chan R L. A matter of quantity: common features in the drought response of transgenic plants overexpressing HD-Zip I transcription factors., 2016, 251: 139–154.

[21] Perotti M F, Ribone P A, Chan R L. Plant transcription factors from the homeodomain-leucine zipper family: I. Role in deve-lopment and stress responses.,2017, 69: 280-289.

[22] Hu J, Chen G, Yin W, Cui B, Yu X, Lu Y, Hu Z. Silencing of SlHB2 improves drought, salt stress tolerance, and induces stress-related gene expression in tomato.,2017, 36: 578–589.

[23] Ni Y, Wang X, Li D, Wu Y, Xu W, Li X. Novel cotton homeobox gene and its expression profiling in root development and in response to stresses and phytohormones.(Shanghai), 2008, 40: 78–84.

[24] Zhang S, Haider I, Kohlen W, Jiang L, Bouwmeester H, Meijer A H, Schluepmann H, Liu C M, Ouwerkerk P B. Function of the HD-Zip I genein ABA-mediated drought and salt tole-rances in rice.Plant Mol Biol2012, 80: 571–585.

[25] Dezar C A, Gago G M, Gonzalez D H, Chan R L., a sunflower homeobox-leucine zipper gene, is a developmental regulator and confers drought tolerance toplants.,2005, 14: 429–440.

[26] Cabello J V, Giacomelli J I, Gomez M C, Chan R L. The sunflower transcription factor HaHB11 confers tolerance to water deficit and salinity to transgenicand alfalfa plants.,2017, 257: 35–46.

[27] Cabello J V, Arce A L, Chan R L. The homologous HD-Zip I transcription factors HaHB1 and AtHB13 confer cold tolerance via the induction of pathogenesis-related and glucanase proteins.,2012, 69: 141–153.

[28] Capella M, Ribone P A, Arce A L, Chan R L.HomeoBox 1 (AtHB1), a Homedomain-Leucine Zipper I (HD-Zip I) transcription factor, is regulated by PHYTOCHROME-INTERACTING FACTOR 1 to promote hypocotyl elongation.,2015, 207: 669–682.

[29] Parveen S, Pandey A, Jameel N, Chakraborty S, Chakraborty N. Transcriptional regulation of chickpea ferritin CaFer1 influences its role in iron homeostasis and stress response.,2018, 222: 9–16.

[30] Ebrahimian-Motlagh S, Ribone P A, Thirumalaikumar V P, Allu A D, Chan R L, Mueller-Roeber B, Balazadeh S. JUNGBRUNNEN1 confers drought tolerance downstream of the HD-Zip I transcription factor AtHB13.,2017, 8: 2118.

[31] Dai M, Hu Y, Ma Q, Zhao Y, Zhou D X. Functional analysis of rice HOMEOBOX4 () gene reveals a negative function in gibberellin responses.2008, 66: 289–301.

[32] Zhou W, Malabanan P B, Abrigo E.regulates GA signaling by interacting with DELLA-like genes and GA oxidase genes in rice.,2015, 201: 97–107.

[33] Zhao Y, Ma Q, Jin X, Peng X, Liu J, Deng L, Yan H, Sheng L, Jiang H, Cheng B. A novel maize homeodomain-leucine zipper (HD-Zip) I gene,, positively regulates drought and salt tolerance in both rice and.,2014, 55: 1142–1156.

[34] Wu J, Zhou W, Gong X, Cheng B. Expression of, a maize homeodomain-Leucine Zipper I gene, confers tolerance to drought stress in transgenic rice.,2016, 34: 845–853.

[35] Guo A Y, Zhu Q H, Chen X, Luo J C. GSDS: gene structure display server.(Beijing), 2007, 29: 1023–1026.

[36] Letunic I, Doerks T, Bork P. SMART: recent updates, new deve-lopments and status in 2015.2015, 43 (Database issue): D257–D260.

[37] Larkin M A, Blackshields G, Brown N P, Chenna R, McGettigan P A, McWilliam H, Valentin F, Wallace I M, Wilm A, Lopez R, Thompson J D, Gibson T J, Higgins D G. Clustal W and Clustal X version 2.0.,2007, 23: 2947–2948.

[38] Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, Kumar S. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods.,2011, 28: 2731–2739.

[39] Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.,2001, 25: 402–408.

[40] Gonzalez-Grandio E, Pajoro A, Franco-Zorrilla J M, Tarancon C, Immink R G, Cubas P. Abscisic acid signaling is controlled by a BRANCHED1/HD-ZIP I cascade in Arabidopsis axillary buds.,2017, 114: E245–E254.

[41] Shao J, Haider I, Xiong L, Zhu X, Hussain R M F, Overnas E, Meijer A H, Zhang G, Wang M, Bouwmeester H J, Ouwerkerk P B F. Functional analysis of the HD-Zip transcription factor genesandin rice.,2018, 13: e0199248.

[42] Olsson A S, Engstrom P, Soderman E. The homeobox genes ATHB12 and ATHB7 encode potential regulators of growth in response to water deficit in.,2004, 55: 663–677.

Genome-wide identification and expression analysis of HD-ZIP I subfamily genes in maize

LIANG Si-Wei1, JIANG Hao-Liang1, ZHAI Li-Hong2, WAN Xiao-Rong1, LI Xiao-Qin1, JIANG Feng1,*, and SUN Wei1,*

1College of Agriculture and Biology, Zhongkai University of Agriculture and Engineering, Guangzhou 510225, Guangdong, China;2Medical College, Hubei University of Arts and Science, Xiangyang 441053, Hubei, China

Transcription factors (TFs) are indispensable regulators of plant response to abiotic stress and play an important role in the whole growth and development process. HD-ZIP proteins constitute a large family of transcription factors that are found only in plants and are divided into four subfamilies (HD-ZIP I–IV). HD-ZIP I subfamily genes mainly participate in response to extreme environments such as drought and osmotic stress and treatments of ABA and ethylene. Here, we identified 17 HD-ZIP I subfamily genes in the maize genome using the hidden Markov model (HMM), which distributed non-uniformly on six chromosomes of maize and were more closely related to rice than to. Furthermore, these HD-ZIP I subfamily genes exhibited multiple expression patterns in seven tissues, showing strong tissues-specific expression. Moreover, maize HD-ZIP I subfamily genes showed different response patterns and degrees to different stresses, such as high salinity, waterlogging and cold stress. In addition, maize HD-ZIP I subfamily genes also showed a complex response pattern under treatment of five different hormones. These results provide valuable reference information for dissecting function and molecular mechanism of HD-ZIP I subfamily genes in maize.

HD-ZIP I subfamily; abiotic stress; expression analysis; maize

2019-07-13;

2019-12-26;

2020-01-15.

10.3724/SP.J.1006.2020.93040

孫偉, E-mail: starking521@126.com, Tel: 020-89003026; 蔣鋒, E-mail:breakthrough@139.com, Tel: 020-89003026

聯(lián)系方式: E-mail:hellosiwei@163.com, Tel: 020-89003026

本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31901565), 廣東省重點(diǎn)領(lǐng)域研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2018B020202013)和廣東省科學(xué)技術(shù)廳項(xiàng)目(粵科產(chǎn)學(xué)研字[2016]176號(hào))資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31901565), the National Key Research and Development Program of Guangdong Province (2018B020202013), and the Program of the Science and Technology Bureau of Guangdong Province ([2016]176)

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20200115.1008.008.html