吳穎峰，董合磊，劉 佳，劉 梅，肖紅梅

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品與科技學(xué)院，江蘇 南京210095）

鱷魚屬于動(dòng)物界脊索動(dòng)物門脊椎動(dòng)物亞門爬行綱鱷形總目鱷科，是現(xiàn)存最古老的動(dòng)物之一[1]。近些年來，在國家政策的大力支持以及鱷魚人工養(yǎng)殖技術(shù)的飛速發(fā)展下，鱷魚肉逐漸從一種稀有食材變成廣大消費(fèi)者都能接觸到的新興食材[2]。據(jù)悉，國內(nèi)鱷魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展快速，總養(yǎng)殖量逐年遞增，但目前養(yǎng)殖地區(qū)仍主要集中在我國南方地區(qū)[3]。鱷魚肉中含有豐富的維生素和礦物元素，口感好，是優(yōu)秀的肉類食材[4]。根據(jù)已有研究表明，鱷魚肉中粗蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為18%，且必需氨基酸與總氨基酸比例高于41%，總必需氨基酸與總非必需氨基酸比例接近73%，在營養(yǎng)學(xué)中屬于FAO/WHO最理想的模式[5]。此外鱷魚肉還具有諸多保健功能，將鱷魚肉凍干磨碎后對人體有抗脂質(zhì)氧化作用，并可改善缺氧引起的癥狀[6]，鱷魚肉也具有清除自由基的能力，能夠抵抗人體的衰老[7-8]。鱷魚肉中脂肪酸種類約有30種，其中多不飽和脂肪酸比例在30%左右，并且富含DHA和EPA，鱷魚肉在脂肪酸含量和組成方面與深海魚接近，具有極高的營養(yǎng)保健價(jià)值[9]。但是鱷魚肉作為一種新興的高價(jià)值肉類，在市場監(jiān)管等方面存在許多不足。

食品摻假和偽造是指人為向食品中摻入外觀難以辨認(rèn)、最終想達(dá)到以次充好的行為[10-11]。在傳統(tǒng)的肉制品行業(yè)中很多商販以次充好，將廉價(jià)劣質(zhì)肉類添加到高價(jià)優(yōu)質(zhì)肉中進(jìn)行售賣，這種行為不但損害了消費(fèi)者利益，還擾亂了市場秩序。鱷魚肉作為一種高蛋白質(zhì)、低脂肪的良好肉質(zhì)，擁有非常良好的市場。隨著鱷魚肉市場的擴(kuò)大，建立一個(gè)完善高效的食品溯源及防偽機(jī)制來應(yīng)對鱷魚肉摻假行為問題是非常重要的。而建立鱷魚肉溯源防偽機(jī)制的關(guān)鍵在于加工肉制品中鱷魚源性的檢測。目前物種的鑒定主要基于蛋白質(zhì)和DNA的分析[12]。而其中又以DNA分析為主，因?yàn)镈NA比蛋白質(zhì)耐熱性更強(qiáng)，更易于在加熱后的食品中鑒定[13]。常規(guī)的DNA分析方法有：常規(guī)PCR-凝膠電泳、多重PCR-凝膠電泳法、熒光定量PCR等[14]。作者將用實(shí)時(shí)SYBR Green熒光PCR技術(shù)來建立檢測方法。因?yàn)樗鳛橐环N利用熒光分子提供的熒光強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物的豐度之間的相關(guān)性來實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)采集，相比于在末期進(jìn)行分析的凝膠瓊脂或聚丙烯酰胺電泳技術(shù)和Taq Man探針實(shí)時(shí)PCR，SYBR Green實(shí)時(shí)PCR的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)更加簡單快捷且不需要探針、成本低[15-19]。在復(fù)雜的混合而成的產(chǎn)品中，即使只有微量的不同物種成分，也能分析出來。

目前國內(nèi)外關(guān)于實(shí)時(shí)熒光PCR方法來測定食品中鱷魚肉源性的研究較少。丁健等人[20]利用SYBR Green熒光定量PCR建立了快速鑒定小體鱘物種的方法，檢測的靈敏度達(dá)0.04 mg/L，可對血液樣品和組織樣品進(jìn)行種源鑒別。陳正芳等人[21]通過SYBR GeenⅠReal time PCR對動(dòng)物源食品中豬源性成分進(jìn)行測定，最后靈敏度達(dá)1×10-6ng/μL。在加工肉制品中檢測鱷魚肉源性的研究較少，尤其是使用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法，因此作者利用SYBR Green熒光定量PCR對鱷魚源性成分進(jìn)行鑒定，通過鱷魚線粒體色素細(xì)胞b基因設(shè)計(jì)特異性引物，并進(jìn)行特異性試驗(yàn)、檢出限試驗(yàn)、靈敏度檢測以及加工制品中鱷魚肉源性的檢測來驗(yàn)證食品中SYBR Green熒光定量PCR在檢測鱷魚肉源性成分的可靠性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛肉、羊肉、豬肉、雞肉、鴨肉、魚肉、蝦肉、牛肉棒、豬肉脯、雞肉腸、培根：均在超市購得；鱷魚肉：購于江蘇蘇州市奧新鱷魚開發(fā)有限公司；泰興分公司，鱷魚肉脯、鱷魚香腸加工：作者所在實(shí)驗(yàn)室制得，使用前均儲(chǔ)存在-20℃冰箱。

EDTA、Tris-HCl、Na2EDTA、蛋白酶k（20 mg/mL）：均購自上海生工公司；CTAB：購自Aladdin公司；氯仿、異丙醇、乙醇：均購自國藥-滬試；實(shí)時(shí)熒光PCR混合液（TB Green?Premix Ex TaqTMII）：大連寶生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：德國Eppendorf公司；QuantStudioTM6 Flex實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀：美國ABI公司；Nnanodrop-2000微量核酸蛋白質(zhì)分析儀：美國熱電公司；恒溫水浴鍋：南京科爾儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank中已發(fā)表的鱷魚（NC008143.1）基因組序列，并用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，再將引物序列在美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST分析比較和評估，保證鱷魚引物的特異性。擴(kuò)增所用引物由上海生工公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列匯總表Table 1 Primers list

1.3.2 DNA的提取稱取100 mg樣品，加入10 μL蛋白酶K（20 mg/mL）、1.5 mL CTAB提取緩沖液（20 g/L CTAB，1.4 mol/L NaCl，0.1 mol/L Tris-HCl，0.02 mol/L Na2EDTA，pH 8.0），樣品于60℃水浴4 h。溶解產(chǎn)物通過13 000 g離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液到新的離心管中。加入750μL氯仿后振蕩，13 000 g離心5 min。取上清液后加入2倍體積的CTAB沉淀溶液（5 g/L CTAB，40 mmol/L NaCl），13 000 g離心15 min。棄上清液并加入350μL NaCl溶液（1.2mol/L NaCl）、350μL氯仿，混勻輕搖，13 000g離心10 min。取上清液后加入0.6倍體積的異丙醇，13 000g離心10 min，棄上清液，加入500μL體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液洗滌沉淀，13 000g離心5 min，棄上清液晾干，溶解于100μL滅菌超純水中，用微量核酸蛋白質(zhì)分析儀測定其質(zhì)量濃度，-20℃保存?zhèn)溆肹29]。

1.3.3 特異性試驗(yàn)將鱷魚、羊、牛、豬、雞、鴨、魚、蝦樣品質(zhì)量濃度用滅菌超純水水調(diào)整為20 ng/μL DNA溶液，并用上述設(shè)計(jì)引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。熒光PCR反應(yīng)體系為20μL，包含TBGreen TaqⅡ10μL、模板DNA 2μL、上下游引物各0.8 μL、滅菌超純水6μL、ROX Reference Dye 0.4μL。反應(yīng)條件根據(jù)試劑盒調(diào)整為：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，64℃退火延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。

1.3.4 檢出限試驗(yàn)將鱷魚DNA梯度稀釋，制備成100、10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 1 ng/μL 7個(gè)質(zhì)量濃度梯度樣品，進(jìn)行檢出限試驗(yàn)。

1.3.5 靈敏度試驗(yàn)用20 ng/μL雞肉DNA溶液稀釋20 ng/μL鱷魚DNA溶液，最后稀釋成鱷魚DNA含量分別為100%、10%、1%、0.1%、0.01%、0.001%、0%的樣品，進(jìn)行靈敏度試驗(yàn)。

1.3.6 肉加工制品樣品鑒定于實(shí)驗(yàn)室制得鱷魚肉脯、鱷魚肉香腸，市場購置培根、豬肉脯、雞肉腸、牛肉棒，用1.3.2方法提取DNA，并調(diào)整樣品DNA質(zhì)量濃度為20 ng/μL，最后利用所建立的SYBR Green熒光PCR檢測方法對肉加工制品進(jìn)行鑒定。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理利用QuantStudioTMReal-Time PCR Software對結(jié)果進(jìn)行擴(kuò)增曲線和Ct值的分析，數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA質(zhì)量分析

通過微量核酸蛋白質(zhì)分析儀測定樣品在260、280 nm的光密度（OD）值，所有樣品的OD260/OD280均在1.8～2.2。結(jié)果表明，所有樣品提取的DNA均適用于PCR檢測，見表2。

表2 不同肉類DNA模板PCR擴(kuò)增的Ct值Table 2 Results of PCR amplification of different meat DNA templates

2.2 特異性試驗(yàn)結(jié)果

以鱷魚、羊、牛、豬、雞、鴨、魚、蝦樣本各20 ng/μL DNA作為模板進(jìn)行PCR，只有鱷魚樣本出現(xiàn)顯著擴(kuò)增，Ct值為20.92±0.05，雞、羊、牛、豬、鴨、魚、蝦樣品的Ct值均大于35，可以認(rèn)為本方法針對鱷魚設(shè)計(jì)的引物特異性良好，見圖1。

圖1 鱷魚引物特異性實(shí)時(shí)熒光PCR檢測結(jié)果Fig.1 Specificity of the crocodile primers

2.3 檢出限試驗(yàn)結(jié)果

通過鱷魚引物對100、10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 1 ng/μL 7個(gè)不同質(zhì)量濃度梯度的樣品DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖2，具體數(shù)值見表3。由圖2和表3可知，100、10、1、0.1、0.01、0.001 ng/μL模板質(zhì)量濃度樣品均出現(xiàn)Ct值小于35的擴(kuò)增，而當(dāng)鱷魚DNA模板質(zhì)量濃度為0.000 1 ng/μL時(shí)，Ct值為35.85±1.25。表明該方法的檢出限為0.001 ng/μL鱷魚DNA質(zhì)量濃度。通過對鱷魚肉樣品DNA進(jìn)行一系列的梯度稀釋（100、10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 1 ng/μL），鱷魚DNA質(zhì)量濃度的對數(shù)值與其對應(yīng)的Ct值成線性關(guān)系，通過以模板質(zhì)量濃度的對數(shù)值為X軸，Ct值為Y軸，得到線性回歸方程見圖3。因此本試驗(yàn)方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=-2.783x+24.618，R2=0.986 2，通過檢測肉制品中的鱷魚源性的Ct值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中的公式，可以得到所測樣品中鱷魚DNA的質(zhì)量濃度，且R2=0.986 2，說明本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的鱷魚引物具有良好的檢測能力。

表3 不同鱷魚DNA模板質(zhì)量濃度PCR擴(kuò)增的Ct值Table3 Results of PCR amplification of different crocodile DNA template concentrations

圖2 鱷魚引物檢出限實(shí)時(shí)熒光PCR檢測結(jié)果Fig.2 Detection limit of crocodile primers real-time PCR results

圖3 鱷魚源性成分定量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve for quantitative detection of crocodile-derived components

2.4 靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

通過鱷魚引物對鱷魚組分DNA和雞肉組分DNA混合樣（鱷魚組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為100%、10%、1%、0.1%、0.01%、0.001%、0）進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增試驗(yàn)，結(jié)果見圖4，具體數(shù)值見表4。當(dāng)鱷魚組分DNA占混合DNA 0.001%的時(shí)，Ct值為35.15±0.13，而鱷魚組分DNA占比為100%、10%、1%、0.1%、0.01%時(shí)，擴(kuò)增Ct值均小于35。結(jié)果表明，該檢測方法在混合DNA樣品中的靈敏度可達(dá)0.01%。

圖4 鱷魚引物靈敏度實(shí)時(shí)熒光PCR檢測結(jié)果Fig.4 Detection results of crocodile primer sensitivity real-time PCR

表4 不同鱷魚組分DNA模板PCR擴(kuò)增的Ct值Table4 Results of PCR amplification of different crocodile DNA template contents

2.5 加工肉制品中鱷魚源性檢測結(jié)果

提取從超市購買的培根、豬肉脯、雞肉腸、牛肉棒以及實(shí)驗(yàn)室制作的鱷魚肉脯、鱷魚肉香腸的DNA，對其進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增試驗(yàn)，結(jié)果見表5和圖5?？梢钥闯?，只有2個(gè)鱷魚肉制品出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，Ct值分別為21.28±0.20、20.58±0.07，其余無鱷魚源性制品均未檢測出其源性，說明此引物具有較高的適用性及特異性，可用于市售加工制品中鱷魚源性的檢測。

圖5 加工肉制品鱷魚源性實(shí)時(shí)熒光PCR檢測結(jié)果Fig.5 Real-time PCR detection results of processed meat products

表5 不同加工肉制品DNA模板PCR擴(kuò)增的Ct值Table 5 Results of PCR amplification of different processed meat products

3 結(jié)語

實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)因其高特異性和高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于肉類及其加工制品物種源性的鑒定。然而目前利用實(shí)時(shí)熒光PCR對鱷魚源性成分進(jìn)行鑒定的研究報(bào)道較少。Naquiah等人通過雙基因靶向PCR技術(shù)對鱷魚肉及其加工制品檢測，最終純鱷魚肉的檢出限為0.001 ng，而混合肉樣的檢出限為0.01 ng[30]。作者選擇鱷魚線粒體細(xì)胞中的色素細(xì)胞b作為目的基因，因具有含量高、多拷貝基因的特點(diǎn)，所以可以達(dá)到較高的特異性及靈敏度，適用于物種源性檢測。相較于Nina等人的雙基因靶向PCR檢測鱷魚源性，本研究所建立的實(shí)時(shí)熒光PCR鑒定鱷魚源性的方法更加方便快捷、成本低且有出色的靈敏度。相比于普通PCR技術(shù)，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)無需電泳就可以對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，省去了對陽性樣品進(jìn)行DNA測序等步驟，增加了檢測效率。

自從牛羊肉摻假事件的曝光，肉制品的摻假已經(jīng)成為消費(fèi)者關(guān)注的熱點(diǎn)問題。鱷魚肉作為一種高蛋白質(zhì)、低脂肪的良好肉質(zhì)，擁有非常良好的市場。隨著鱷魚肉市場的擴(kuò)大，建立一個(gè)完善高效的食品溯源及防偽機(jī)制來應(yīng)對將會(huì)出現(xiàn)的鱷魚肉摻假行為問題是非常重要的。本研究建立的方法可檢測出0.001 ng/μL的鱷魚肉，靈敏度可達(dá)0.01%，且該特異性引物只能擴(kuò)增出鱷魚源性成分，對羊、牛、豬、雞、鴨、魚、蝦樣品均無特異性擴(kuò)增。因此在對冒充鱷魚肉售賣、加工產(chǎn)品中違規(guī)添加鱷魚肉以及鱷魚肉制品中摻入低價(jià)值肉等現(xiàn)象時(shí)該試驗(yàn)方法能夠作為監(jiān)管有效手段篩查，通過該方法可以有效維持鱷魚肉肉制品市場的秩序，維護(hù)消費(fèi)者的權(quán)益。