彭樹英，李 俊，萬勝豪，汪 敏，汪 玲，汪承巧，韓蒙蒙，汪雨晨，耿雪俠，張海軍①

（淮北師范大學 生命科學學院，資源植物生物學安徽省重點實驗室，安徽 淮北235000）

0 引言

冬蟲夏草（Ophiocordyceps sinensis）為麥角菌科（Clavicipitaceae）冬蟲夏草菌（Ophiocordyceps sinensis（Berk.）G．H．Sung et al.（Cordyceps sinensis Berk.））寄生在蝠蛾屬（Hepialus）昆蟲幼蟲上長出的子座及幼蟲尸體所形成的蟲菌復合體［1～3］. 感染此種真菌的昆蟲幼蟲在冬天形成致密的菌核即“冬蟲”，至次年春末夏初之際蟲體頭部長出子座破土而出，即“夏草”［1-3］. 冬蟲夏草是一種極為珍貴的中藥材，具有補肺益腎［4］、止咳化痰、調節(jié)免疫力［5］、降血糖降血脂［6-7］、抗腫瘤［8］、抗氧化［9］和抗衰老［10］等多種功效. 冬蟲夏草寄主昆蟲的地理分布雖較獨特，但有其特定規(guī)律，主要分布于青海、西藏、四川、云南和甘肅五省境內海拔3 000 m以上的青藏高原高寒草甸區(qū)［11］. 冬蟲夏草菌主要寄主昆蟲為蝠蛾屬昆蟲，根據(jù)傳統(tǒng)形態(tài)學分析，中國境內記錄的蝠蛾屬昆蟲累計達到六十多種，據(jù)推測，未發(fā)現(xiàn)的種類可能會更多［12-13］. 1968年，Viette［14］以雄性生殖器抱器瓣底部明顯的突起為依據(jù)，在蝙蝠蛾科下建立鉤蝠蛾屬（Thitarodes）. 隨后，國外學者［15～17］將大部分蝠蛾種類歸于此屬. 由于昆蟲形態(tài)變化的可塑性及趨同進化導致傳統(tǒng)分類法不夠準確［18］，而且對冬蟲夏草寄主的研究也多側重于形態(tài)特征、生物學特性分析，或蝠蛾屬昆蟲的種類和地理分布的研究［19～25］，對我國不同產(chǎn)地冬蟲夏草寄主昆蟲之間的分子遺傳進化關系的研究報道也較少，這將直接影響冬蟲夏草種質資源的保護和有效利用［12］.

線粒體DNA（mtDNA）為雙鏈共價閉合環(huán)狀DNA，具有結構簡單、無組織特異性、嚴格遵守母系遺傳、不易發(fā)生重組、進化速率快等特點［11］. mtDNA是研究動物遺傳多樣性和分子進化的有效標記，已廣泛用于昆蟲分類和分子系統(tǒng)學的研究. 一些學者嘗試將形態(tài)分類方法和分子生物學方法結合，以彌補傳統(tǒng)方法的不足. 陳永久等［26］曾利用線粒體細胞色素b 基因（Cytochrome b，Cyt b）序列首次分析5 種冬蟲夏草寄主蝠蛾的分子進化關系. 程舟等［12］通過對冬蟲夏草寄主蝠蛾的線粒體Cyt b基因片段的序列分析，構建分子系統(tǒng)樹，分析我國冬蟲夏草寄主蝠蛾種屬的系統(tǒng)進化關系和地域分布格局. 鄒志文等［13，18］以蝠蛾雄性生殖器抱器瓣結構特征為依據(jù)，修訂現(xiàn)行中國蝠蛾屬昆蟲分類系統(tǒng)，將中國蝠蛾屬的62個種分別歸入擬蝠蛾屬（Parahepialus）、蝠蛾屬（Hepialus）、鉤蝠蛾屬（Thitarodes）及無鉤蝠蛾屬（Ahamus）等4個屬中，同時利用26 種原蝠蛾屬種類Cyt b基因片段構建系統(tǒng)進化樹，證明將蝠蛾雄性抱器瓣特征作為分屬依據(jù)是合理可信的. 陳抒云等［27］對冬蟲夏草和其它蟲草等物種的寄主昆蟲分別通過COⅠ基因和Cyt b 基因進行條形碼分析，表明COⅠ序列更適用于蟲草寄主昆蟲的DNA 條形碼研究. 近幾年，一些學者為深入研究蟲草寄主蝠蛾的分子進化及其分類，已相繼測定多條蟲草寄主蝠蛾mtDNA全基因組序列［11，18，28～31］.

作為分子標記，研究動物進化的mtDNA應用最多的是Cyt b，細胞色素氧化酶亞基Ⅰ（COⅠ），NADH脫氫酶亞基（ND4），12S rRNA基因，A+T富集區(qū)，腺苷三磷酸酶（ATP6或ATP8）等［32］. 16S rRNA基因亦是線粒體基因組中研究較多的基因，既含有保守序列，又含有與進化距離相適應的可變序列，被稱為進化分子鐘［32］. 16S rRNA基因用于評價生物的遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)生關系的報道很多［33～38］，但在冬蟲夏草寄主蝠蛾方面的研究尚未見報道. 本研究運用線粒體16S rRNA基因序列對不同蟲草寄主蝠蛾的進化關系進行分析，以期為進一步的遺傳系統(tǒng)進化分析、種質鑒定和資源保護奠定理論依據(jù).

1 材料和方法

1.1 基因序列來源

目前已登錄至GenBank的蝠蛾科線粒體基因組全序列共有11條記錄，其中7條為蟲草寄主蝠蛾（其中6種蝠蛾基因序列有兩個序列號），亞香棒蟲草寄主蝠蛾1條，其他蝠蛾3條（其中2種蝠蛾基因序列有兩個序列號），從GenBank中獲取并下載蝠蛾科、其他科蛾類及果蠅（外群）線粒體16S rRNA和COⅠ基因序列（表1）.

表1 本研究序列來源及信息

表1（續(xù)）

1.2 數(shù)據(jù)處理和系統(tǒng)進化分析

將從NCBI 中獲取的序列保存為Fasta 格式，用ClustalX 2.1 軟件進行序列對比. 然后將比對序列用MEGA 7.0軟件統(tǒng)計不同蝠蛾科16S rRNA基因序列間的簡約位點、可變位點、保守位點以及種間遺傳間距，并構建系統(tǒng)進化樹. 用DAMBE軟件分析基因序列的堿基組成，并分析AT或GC偏斜性，計算公式為AT-skew=［A-T］/［A+T］和GC-skew=［G-C］/［G+C］［39］. 本研究基于冬蟲夏草、亞香棒蟲草的寄主昆蟲（蝠蛾類）及其他蛾類的16S rRNA基因用NJ法構建系統(tǒng)進化樹. 為評估16S rRNA基因作為分類依據(jù)分子標記的可靠性，同時用相同物種線粒體基因組序列的16S rRNA 聯(lián)合COⅠ基因構建ML 系統(tǒng)進化樹. 將系統(tǒng)進化樹中bootstrap自檢值設置為1 000.

2 結果

2.1 序列堿基組成分析

將16S rRNA 基因序列進行對比排列后，長度為1 411 bp，其中保守位點1 054個，簡約位點143個，可變位點310個. 通過計算可知，A、C、G、T堿基的平均含量分別為44.1%、5.3%、9.6%、40.0%. A+T的平均含量為85.0%，明顯高于G+C 含量（15%）. 由表2 可知，AT 和GC 的偏斜度均為正值且小于1，最小ATSkew值為0.005（T.sylvina），最大AT-Skew值為0.045（A.yunnanensis），最小GC-Skew值為0.26（T.sp.），最大GC-Skew值為0.326（H.xiaojinensis），說明11種蝠蛾堿基組成對AT顯著偏移.

表2 11種蝠蛾的16S rRNA基因堿基組成

2.2 蝠蛾科11種蝠蛾的種間遺傳距離

由表3可知，在11種蝠蛾中，種間遺傳距離范圍在0.005～0.117之間，人支蝠蛾（T.renzhiensis）與阿爾泰蝠蛾（T.sp.）和貢嘎蝠蛾（T.gonggaensis）的種間遺傳距離為最小（0.005），T.sylvina與蒲氏鉤蝠蛾（T.pui）間的遺傳距離是最大（0.117）. 蟲草寄主蝠蛾間的遺傳距離為0.005～0.51.T.sylvina與其他蝠蛾的遺傳距離范圍在0.099～0.117，相比其他蝠蛾間的遺傳距離明顯偏大.

表3 11種蝠蛾16S rRNA基因的遺傳距離

2.3 系統(tǒng)進化分析

基于16S rRNA基因和COⅠ基因聯(lián)合16S rRNA基因構建的系統(tǒng)進化樹均明顯分為兩個大分支. 在NJ樹（如圖1）中第Ⅰ支由蝠蛾科昆蟲包括蟲草寄主蝠蛾及其他蝠蛾構成. 在蟲草寄主蝠蛾中，人支蝠蛾（T.renzhiensis）與阿爾泰蝠蛾（T.sp.）聚為一支，與貢嘎蝠蛾（T.gonggaensis）及小金蝠蛾（H.xiaojinensis）聚成一簇，與色季拉山蝠蛾（T.sejilaensis）與蒲氏鉤蝠蛾（T.pui）聚成的一支構成姊妹群. 云南蝠蛾（A.yunnanensis）位于此支系的基部（自展值100%）. 7種蟲草寄主蝠蛾構成一個獨立的大支系（自展值為100%），表明屬間親緣關系較近. 如蝠蛾屬的兩種蝠蛾（Endoclita signifer和Endoclita minanus）單獨聚類在一起，與湖南棒蝠蛾（N.hunanensis）和Triodia sylvina位于蟲草寄主蝠蛾類群的基部. 而在ML樹中（如圖2），蟲草寄主蝠蛾聚類與NJ樹中一致，但非蟲草寄主蝠蛾中N.hunanensis與T.sylvina單獨形成一個支系，E.signifer和E.minanus聚類形成另一個單獨支系. 兩種樹中第Ⅱ大支均由蠶蛾科、織蛾科、菜蛾科、卷蛾科、舉肢蛾科和麥蛾科蛾類構成，NJ 樹中蠶蛾科的家蠶Bombyx mori與Bombyx huttoni聚類形成一支，然后與菜蛾（Plutella xylostella）和卷蛾（Spilonota lechriaspis）形成一支. 舉肢蛾科、織蛾科和麥蛾科聚類形成另一支.ML樹中的第Ⅱ大支稍有不同，蠶蛾科單獨聚類成一支，菜蛾（Plutella xylostella）和卷蛾（Spilonota lechriaspis）也聚類成一支，其余科的蛾類均單獨形成一支（如圖1和圖2）.

圖1 基于線粒體16S rRNA基因構建的NJ樹

圖2 基于16S+COⅠ基因構建的ML樹

3 討論

16S rRNA基因之所以成為常用的線粒體分子標記，主要原因有如下幾點：一是該基因存在于所有昆蟲的體內；二是16S rRNA 基因的保守性和特異性比較高［37］；三是該基因序列較長，約含有50 個功能域［37］. COⅠ基因在線粒體DNA中分布普遍，具有多態(tài)性較高、基因進化速率適中、適于通用引物擴增等特點，是昆蟲分子系統(tǒng)學研究中較為理想的分子標記，該基因近年來在昆蟲的群體遺傳結構和系統(tǒng)進化方面有較多的研究［40］. 因此，在本研究中同時用蟲草寄主蝠蛾16S rRNA基因聯(lián)合COⅠ全基因構建系統(tǒng)進化樹，以驗證16S rRNA構建系統(tǒng)進化樹的可靠性和有效性.

通過對蝠蛾科蝠蛾線粒體16S rRNA 基因序列進行分析，結果表明：序列中A+T 的平均含量為85.0%，G+C的平均含量為15.0%，堿基組成對A+T表現(xiàn)為顯著的偏移. 種間的最小遺傳距離為0.005（T.renzhiensis與T.sp.，T.renzhiensis與T.gonggaensis），說明三者的親緣關系較其他蛾類更近. 將蟲草寄主蝠蛾、其他蝠蛾及其他科蛾類的16S rRNA 基因全序列約1 400 bp個堿基作為系統(tǒng)進化樹的分析位點. NJ系統(tǒng)樹明顯分為2大支（圖1所示）：第Ⅰ支由蝠蛾科昆蟲包括蟲草寄主蝠蛾及其他蝠蛾，7種蟲草寄主蝠蛾最先聚為一支，其中人支蝠蛾（T.renzhiensis）、阿爾泰蝠蛾（T.sp.）與貢嘎蝠蛾（T.gonggaensis）同屬鉤蝠蛾屬聚為一簇（種間遺傳距離最?。?，小金蝠蛾（H.xiaojinensis）與3種鉤蝠蛾屬蝠蛾形成一個支系，說明小金蝠蛾（H.xiaojinensis）應為鉤蝠蛾屬，這一結果印證并支持Kang［11］等的研究結論. 這一支系與色季拉山蝠蛾（T.sejilaensis）和蒲氏鉤蝠蛾（T.pui）形成的聚類簇互為姊妹群，而云南蝠蛾（A.yunnanensis）屬無鉤蝠蛾屬，獨立成一支. 以上結果與相關研究報道［11，18，29］所得結論一致. 同時發(fā)現(xiàn)，蟲草寄主蝠蛾分布地域較近的也更趨于歸為一類，如蒲氏鉤蝠蛾（T.pui）和貢嘎蝠蛾（T.gonggaensis）均分布于西藏林芝地區(qū). 湖南棒蝠蛾（N.hunanensis）是亞香棒蟲草的寄主昆蟲，并不是冬蟲夏草的寄主昆蟲，但兩種蟲草形態(tài)卻極為相似，說明兩種蟲草寄主蝠蛾可能具有較近的親緣關系. 進化樹分析結果亦表明，在非蟲草寄主蝠蛾中湖南棒蝠蛾（N.hunanensis）的確是與所有冬蟲夏草寄主蝠蛾關系較近的一支，而其他蝠蛾與蟲草寄主蝠蛾關系明顯稍遠一些. 本研究分析蟲草寄主蝠蛾間的進化關系而得出的結論與Zou等［18］和Kang等［11］的觀點基本一致. 本研究同時也用來源于相同物種線粒體基因組的COⅠ基因聯(lián)合16S rRNA構建ML進化樹（圖2所示），與單獨用16S rRNA基因構建的進化樹結果相符，在一定程度上支持鄒志文等［13］提出形態(tài)學分類的觀點，即將蝠蛾屬以雄性生殖器抱器瓣結構特征為依據(jù)分為4個屬的合理性. 這也說明16S rRNA基因可以進行科屬級分類，作為系統(tǒng)進化分析和分類的標記基因是有效且可信的.

本研究中樣本數(shù)有所欠缺，分布區(qū)域不均，因此今后研究過程中為更全面具體地進行系統(tǒng)分類，還需要增加種群數(shù)量并結合其他分析技術手段，從而為蟲草寄主昆蟲的系統(tǒng)進化研究提供更全面的科學依據(jù)，同時為藥用蟲草資源的保護和利用奠定理論依據(jù).