溫培楠，林明恕，金 冕，徐賢綢，陳龍?jiān)?/p>

1.浙江省平陽(yáng)人民醫(yī)院普外科，浙江 溫州 325400；

2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430065

胃癌作為全球范圍內(nèi)主要的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一，2017年胃癌在中國(guó)癌癥發(fā)病率中排名第二，在癌癥相關(guān)死亡的原因中位列第四。早期胃癌缺乏典型臨床癥狀，同時(shí)胃癌的血供極為豐富，早期就可能發(fā)生腹腔轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致胃癌患者的預(yù)后較差［1-2］。盡管在早期診斷和治療方面做出了巨大努力，但應(yīng)用于臨床胃癌的傳統(tǒng)化療藥物效果不甚理想，目前抑制腫瘤新生血管形成已成為研發(fā)抗癌藥物的新方向，已有諸多抗血管生成靶向藥物如多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑-索拉非尼和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）/血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）單抗-阿西替尼等應(yīng)用于臨床胃癌化療，取得顯著療效，但大多靶向藥物均存在一定程度的不良反應(yīng)，同時(shí)很多患者對(duì)靶向藥物存在不同程度的耐藥，提高總體生存率的進(jìn)展相對(duì)緩慢［3-4］。尋找低毒、高效的抗胃癌藥物以改善胃癌患者預(yù)后具有十分重要的臨床意義。

二氫楊梅素（dihydromyricetin，DHM）是從延胡索屬的葉中分離的一種氫化黃酮醇類有機(jī)物，藥理研究表明，DHM具有對(duì)抗炎癥因子、抑制細(xì)菌生長(zhǎng)和舒張小動(dòng)脈等多種功效［5-6］。此外，DHM還可抑制肺癌、肝癌和結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤生長(zhǎng)，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，同時(shí)對(duì)正常人體細(xì)胞幾乎沒(méi)有細(xì)胞毒效應(yīng)［7-8］，從而為天然產(chǎn)物應(yīng)用于臨床抗腫瘤藥物提供了更多的選擇。然而，DHM對(duì)惡性腫瘤血管生長(zhǎng)的影響尚未可知，本研究將圍繞DHM對(duì)體外人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）侵襲和小管形成、體內(nèi)胃癌生長(zhǎng)和血管生成、蛋白水平的機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)性研究。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞系和主要試劑

HUVEC和人胃癌細(xì)胞系MKN28購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）；DHM、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）和Drabkin 525試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司；含EDTA胰蛋白酶購(gòu)自杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；Matrix基質(zhì)膠和Transwell小室購(gòu)自美國(guó)BD公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒和RIPA裂解物購(gòu)自北京中山生物工程有限公司；VEGFA、phospho-VEGFR2、Total-VEGFR2、phospho-細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、Total-ERK、phospho-c-Jun氨基端激酶（c-Jun NH2-terminal kinase，JNK）和Total-JNK抗體購(gòu)自美國(guó)Epitomics公司；phospho-p38、Total-p38和β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

采用DMEM培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培育，同時(shí)在DMEM培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清，細(xì)胞放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱環(huán)境中，使用含EDTA胰蛋白酶消化，按照1∶3的比例進(jìn)行傳代。

1.3 配制藥液

把100 mg的DHM添加至10 mL的DMSO內(nèi)，制作得到10 mg/mL的液體成分，隨后妥善放置4 ℃環(huán)境中，臨使用時(shí)將母液置于37 ℃水浴箱內(nèi)溶解后再添加DMEM培養(yǎng)基稀釋成所需濃度，0.1%為DMSO在DHM溶液中濃度的上限，0.1%DMSO對(duì)細(xì)胞活力無(wú)顯著抑制作用。使DHM濃度梯度為0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0和100.0 mmol/L，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力

HUVEC或MKN28細(xì)胞加入96孔板中，每孔中分配2×104個(gè)細(xì)胞，藥物初步處理后放在37 ℃環(huán)境中4 h，隨后將10 μL的CCK-8試劑添加至每個(gè)96孔板中，借助酶標(biāo)儀對(duì)吸光度值進(jìn)行檢測(cè)和記錄。

1.5 細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)

每個(gè)Transwell上室鋪有一層Matrix基質(zhì)膠模擬體內(nèi)環(huán)境，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC或MKN28細(xì)胞懸液，經(jīng)冰PBS緩沖液洗滌3次，并將細(xì)胞懸液的密度調(diào)節(jié)至2×105/mL，將20 μL細(xì)胞懸液加至Transwell上室，再將500 μL的DMEM完全培養(yǎng)基加入Transwell下室，Transwell小室置于37 ℃中溫育過(guò)夜后加入1～2滴結(jié)晶紫試劑，反應(yīng)15 min后在光學(xué)顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)移至Transwell小室背側(cè)的細(xì)胞，在×200視野下隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野下的藍(lán)染細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.6 小管形成實(shí)驗(yàn)

將不含胎牛血清的培養(yǎng)基和Matrigel基質(zhì)膠放置冰箱冷藏柜內(nèi)12 h，待其變成膠凍狀，以1∶2的比例混合培養(yǎng)基和Matrigel基質(zhì)膠，將250 μL稀釋后的Matrigel基質(zhì)膠加入24孔板中，再放入37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中溫育1 h，觀察到Matrigel基質(zhì)膠凝結(jié)成塊。將HUVEC懸液的密度調(diào)節(jié)至3×106/mL，將0.1 mL細(xì)胞液滴加至預(yù)先鋪好基質(zhì)膠的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，最后放入37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，在光學(xué)顯微鏡下對(duì)小管形成狀況進(jìn)行觀察和拍照。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)

HUVEC或MKN28細(xì)胞在細(xì)胞裂解液的作用下提取蛋白，總蛋白經(jīng)勻漿、離心和變性等操作后，使用凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上后通過(guò)脫脂奶粉進(jìn)行封閉操作，整體實(shí)驗(yàn)環(huán)境為4℃，維持12 h，硝酸纖維素膜分別經(jīng)過(guò)一抗和二抗的溫育后，利用顯影定影試劑盒完成最后的顯色和曝光操作。

1.8 基質(zhì)膠塞實(shí)驗(yàn)

3～7周的BALB/c雌小鼠從中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院購(gòu)得，裸小鼠放置在層流凈化屏障系統(tǒng)內(nèi)飼養(yǎng)。將Matrigel基質(zhì)膠放置4 ℃下12 h，待其變成液態(tài)，實(shí)驗(yàn)分對(duì)照組、VEGFA組和VEGFA+DHM組，每組5只裸鼠，對(duì)照組裸鼠經(jīng)皮下注射Matrigel基質(zhì)膠0.5 mL，VEGFA組裸鼠經(jīng)皮下注射添加VEGFA（20 μg/L）的Matrigel基質(zhì)膠0.5 mL，VEGFA+DHM組裸鼠皮下注射物為混勻VEGFA（20 μg/L）和DHM（5 mmol/L）的Matrigel基質(zhì)膠0.5 mL，皮下注射部位為裸小鼠的腹中線附近。Matrigel基質(zhì)膠注射入皮下組織后迅速形成一個(gè)膠塞，1周后處死裸鼠取出基質(zhì)膠塞，嚴(yán)格根據(jù)Drabkin 525試劑盒的說(shuō)明書的步驟和說(shuō)明進(jìn)行血紅蛋白濃度測(cè)定。

1.9 建立裸鼠MKN28移植瘤模型

在DMEM培養(yǎng)基中重懸MKN28細(xì)胞，并將細(xì)胞懸液的密度調(diào)節(jié)至3×107/mL。將0.2 mL懸浮腫瘤細(xì)胞液皮下注射到裸小鼠的右下肢，接受注射2周后，皮下異種移植物的體積在裸小鼠可長(zhǎng)達(dá)100 mm3或更大，將10只注射腫瘤細(xì)胞成功的荷瘤裸小鼠按隨機(jī)數(shù)表法分為對(duì)照組和DHM組，對(duì)照組5只裸小鼠經(jīng)灌胃給予0.1%DMSO（0.2 mL/只），DHM組5只裸小鼠經(jīng)食管插管給予DHM（30 mg/kg），調(diào)整每次給藥劑量為0.2 mL，每天1次，共2周。在第4周結(jié)束時(shí)，終止體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，取皮下腫瘤組織稱重并進(jìn)行H-E染色。

1.10 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Ki-67增殖指數(shù)及CD34、VEGFA的表達(dá)

所有樣品用5%甲醛溶液固定過(guò)夜，用梯度乙醇脫水法將腫瘤組織進(jìn)行脫水處理，包埋在石蠟中，并切片。根據(jù)SP染色法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，Ki-67陽(yáng)性染色少數(shù)位于細(xì)胞質(zhì)中，大都在細(xì)胞核中，CD34少數(shù)表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，絕大部分表達(dá)于細(xì)胞膜中，VEGFA陽(yáng)性表達(dá)大都在細(xì)胞質(zhì)中，隨機(jī)選擇20個(gè)視野并在低倍鏡下拍照，使用Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件分析Ki-67和VEGFA在樣本中的積分光密度（IOD）值，在×200光學(xué)顯微鏡下選取10個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野下CD34陽(yáng)性細(xì)胞，取平均值。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

在該實(shí)驗(yàn)中獲得的所有測(cè)量數(shù)據(jù)表示為，并且通過(guò)ANOVA方差SNK-q方法分析兩個(gè)樣品之間的差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DHM對(duì)體外MKN28細(xì)胞或HUVEC生長(zhǎng)的影響

將依次濃度升高的DHM（0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0和100.0 mmol/L）分別作用MKN28細(xì)胞或HUVEC，24 h后經(jīng)CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活力情況，結(jié)果表明低濃度DHM（0.5～10.0 mmol/L）對(duì)體外MKN28細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)明顯抑制作用，最高濃度（100.0 mmol/L）的DHM作用MKN28細(xì)胞后僅使細(xì)胞存活率從100.00%（對(duì)照組）降低到（59.21±12.34）%。而HUVEC對(duì)DHM的敏感性明顯高于MKN28細(xì)胞，低濃度（0.5～2.5 mmol/L）的DHM對(duì)HUVEC活力無(wú)明顯影響，但較高濃度（5～100 mmol/L）的DHM可有效抑制HUVEC活力，呈濃度依賴關(guān)系（圖1），2.5 mmol/L的DHM對(duì)約90%的HUVEC沒(méi)有明顯的毒性，表明濃度不超過(guò)2.5 mmol/L的DHM對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有影響，因此本研究選擇0.5～2.5 mmol/L的DHM進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同濃度DHM對(duì)體外MKN28細(xì)胞或HUVEC活力的影響Fig.1 The viability of MKN28 cells and HUVEC after DHM treatment was detected by performing CCK-8 assay

2.2 DHM對(duì)HUVEC侵襲和小管形成的抑制作用

首先，采用細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)對(duì)DHM處理后的MKN28細(xì)胞侵襲行為進(jìn)行分析。如圖2A所示，依次濃度升高的DHM（0.5、1.0、2.5 mmol/L）作用于MKN28細(xì)胞后對(duì)MKN28細(xì)胞侵襲行為無(wú)明顯影響，與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。而VEGFA（20 mg/L）處理明顯增強(qiáng)了MKN28細(xì)胞侵襲行為，與DHM（2.5 mmol/L）組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

如圖2B所示，相同濃度的DHM對(duì)HUVEC侵襲行為的抑制作用明顯強(qiáng)于MKN28細(xì)胞，（0.5、1.0、2.5 mmol/L）的DHM作用HUVEC后，侵襲細(xì)胞數(shù)分別為31.6±5.6、27.2±3.9和25.6±4.3，DHM可以明顯抑制HUVEC的侵襲行為，與對(duì)照組（57.8±8.9）比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

其次，利用小管形成實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)DHM對(duì)體外HUVEC的體外血管生成能力，如圖2C所示，HUVEC在體外鋪滿Matrigel基質(zhì)膠的培養(yǎng)板中生長(zhǎng)12 h后，細(xì)胞逐漸向兩端延長(zhǎng)呈梭形，同時(shí)細(xì)胞延長(zhǎng)端開(kāi)始在Matrigel基質(zhì)膠中伸展，相鄰細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)聯(lián)接并出現(xiàn)管腔樣結(jié)構(gòu)，0.5、1.0、2.5 mmol/L的DHM作用于HUVEC后，體外小管形成數(shù)分別為24.3±4.8、21.4±3.9、20.6±3.2，均顯著低于對(duì)照組（52.6±7.2），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），表明DHM可有效地抑制HUVEC體外小管形成能力。而VEGFA（20 mg/L）處理可一定程度上逆轉(zhuǎn)DHM對(duì)HUVEC侵襲和小管形成能力的抑制作用，與DHM（2.5 mmol/L）組相比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。綜上所述，以上結(jié)果表明低濃度DHM無(wú)明顯細(xì)胞毒作用，但可有效地抑制HUVEC體外血管生成能力。

圖2 不同濃度DHM對(duì)體外MKN28細(xì)胞和HUVEC侵襲能力及小管形成作用的影響Fig.2 Effects of DHM on the invasive abilities of MKN28 and HUVEC cells in vitro and tube formation

2.3 DHM對(duì)MKN28細(xì)胞和HUVEC中ERK/VEGFA/VEGFR2通路相關(guān)蛋白水平的影響

為探討DHM對(duì)HUVEC發(fā)揮血管生成抑制作用的分子機(jī)制，應(yīng)用Western blot法測(cè)定ERK/VEGFA通路蛋白在MKN28細(xì)胞中的含量。如圖3A所示，用（0.5、1.0、2.5 mmol/L）的DHM作用于MKN28細(xì)胞后，可導(dǎo)致VEGFA和phospho-ERK的表達(dá)隨DHM濃度升高而下降，而DHM對(duì)MKN28細(xì)胞中phospho-p38和phospho-JNK的表達(dá)無(wú)明顯影響。另外，相同濃度DHM作用HUVEC后可呈濃度依賴性抑制HUVEC中phospho-VEGFR2的表達(dá)（圖3B）。

圖3 DMY對(duì)體外MKN28細(xì)胞和HUVEC中ERK/VEGFA/VEGFR2信號(hào)通路蛋白水平的影響Fig.3 Effects of DMY on the protein expression levels of ERK/VEGFA/VEGFR2 pathway factors in MKN28 cells and HUVEC detected by Western blot

2.4 DHM對(duì)體內(nèi)血管生成的影響

為進(jìn)一步明確DHM對(duì)血管生長(zhǎng)的調(diào)控作用，應(yīng)用基質(zhì)膠塞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DHM對(duì)體內(nèi)血管生成的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果后留取3組膠塞如圖4A所示，對(duì)照組基質(zhì)膠塞色灰白，散在血管分布；加入VEGFA（20 μg/L）的基質(zhì)膠塞在裸鼠皮下組織血管化明顯，色澤暗紅，在顯微鏡下可見(jiàn)血管內(nèi)大量紅細(xì)胞，表明新生血管在基質(zhì)膠塞中形成，對(duì)照組和VEGFA組血紅蛋白濃度分別為（3.62±0.59）g/L和（32.70±6.80）g/L，兩組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；而VEGFA+DHM組基質(zhì)膠塞在巨觀下可見(jiàn)新生血管數(shù)量較VEGFA組明顯減少，其血紅蛋白濃度為（9.10±1.50）g/L，較VEGFA組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

2.5 DHM對(duì)MKN28裸鼠移植瘤生長(zhǎng)和血管生成的影響

隨后通過(guò)建立MKN28裸鼠皮下移植瘤研究DHM對(duì)體內(nèi)胃癌生長(zhǎng)及血管新生的影響。首先通過(guò)在DHM（30 mg/Kg）用藥的2周內(nèi)每日監(jiān)測(cè)裸鼠體質(zhì)量變化（圖4B），對(duì)照組裸鼠體質(zhì)量從給藥前的（20.71±0.32）g升至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的（21.53±0.23）g，而DHM組裸鼠體質(zhì)量在給藥前和實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)分別為（20.86±0.36）g和（20.65±0.32）g，兩組裸鼠體質(zhì)量在給藥前和實(shí)驗(yàn)結(jié)束后差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），從而表明本次實(shí)驗(yàn)所選用的DHM劑量（30 mg/Kg）對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無(wú)明顯不良反應(yīng)。

在4周處死裸鼠后，將皮下腫瘤仔細(xì)剝離并稱重，兩組裸鼠尸檢結(jié)果如圖4C所示，對(duì)照組平均腫瘤質(zhì)量為（0.45±0.09）g，DHM組平均腫瘤質(zhì)量為（0.14±0.03）g，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

H-E染色后在鏡下可見(jiàn)對(duì)照組腫瘤細(xì)胞為低分化胃癌，增殖活躍，腫瘤中血供豐富，DHM組腫瘤細(xì)胞增生相對(duì)較慢，血供較為貧乏，可見(jiàn)大量組織壞死（圖4D）；免疫組織化學(xué)法測(cè)定Ki-67、CD34和VEGFA在裸鼠皮下異種移植物中的陽(yáng)性染色情況如圖4D所示，對(duì)照組和DHM組腫瘤組織中Ki-67的IOD值分別為156.63±30.35和138.67±22.54，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；對(duì)照組和DHM組腫瘤組織中CD34陽(yáng)性表達(dá)分別是32.1±6.43和11.7±3.49，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；VEGFA在對(duì)照組和DHM組腫瘤組織中的IOD值分別為284.91±53.86和104.64±24.32，VEGFA在DHM組中的陽(yáng)性表達(dá)較對(duì)照組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

圖4 DHM對(duì)小鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的影響Fig.4 The effect of DHM on tumor cell growth in vivo

3 討 論

DHM作為一種近年來(lái)藥理學(xué)研究非常深入的活性氫化黃酮醇類有機(jī)物，在多種疾病模型中具有良好效果［5-6］。同時(shí)DHM具有優(yōu)秀的抑癌效應(yīng)，但既往將DHM用于體外抗癌研究的濃度范圍大多為50～100 μmol/L［7-8］，在其發(fā)揮抗癌效應(yīng)的同時(shí)不可避免地會(huì)產(chǎn)生一定的不良反應(yīng)。為此，本研究首先使用依次增高濃度的DHM分別作用體外胃癌MKN28細(xì)胞和HUVEC，發(fā)現(xiàn)低濃度（0.5～10.0 μmol/L）的DHM對(duì)體外胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲行為無(wú)明顯抑制作用，但HUVEC對(duì)DHM的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)更加敏感，5.0 μmol/L的DHM即可有效抑制體外HUVEC生長(zhǎng)，同時(shí)更低濃度范圍（0.5～2.5 μmol/L）的DHM對(duì)體外HUVEC的侵襲和小管形成具有明顯抑制作用。另外在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，較低劑量（30 mg/Kg）的DHM對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無(wú)明顯的不良反應(yīng)，但低劑量的DHM對(duì)胃癌皮下移植瘤生長(zhǎng)和血管新生具有明顯抑制效應(yīng)。這是首次全面報(bào)道DHM在低劑量下對(duì)體內(nèi)外細(xì)胞無(wú)明顯的不良反應(yīng)，但可通過(guò)阻斷腫瘤血管生成，從而抑制惡性腫瘤生長(zhǎng)，本研究表明DHM可望作為一種低毒高效的血管生成抑制劑用于臨床胃癌治療。

血管內(nèi)皮細(xì)胞在細(xì)胞炎性信號(hào)、切應(yīng)力和激素水平等信號(hào)的作用下，可分泌多種血管活性物質(zhì)，從而調(diào)節(jié)血液穩(wěn)態(tài)、新生血管形成和組織再生。腫瘤組織中的血管內(nèi)皮細(xì)胞在組織形態(tài)、增生方式和免疫學(xué)特征等方面和正常組織血管內(nèi)皮細(xì)胞存在較大差異，腫瘤組織內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生為順應(yīng)腫瘤生長(zhǎng)的需要，在腫瘤細(xì)胞分泌的多種促血管生長(zhǎng)因子的作用下，腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的活力、侵襲能力及新生血管能力均得到不同程度增強(qiáng)，以適應(yīng)腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移的需要。一般而言，腫瘤生長(zhǎng)至1 mm3時(shí)就需要新生血管生成以維系惡性腫瘤不斷增殖所需要的養(yǎng)分。為此，根據(jù)腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞的特點(diǎn)，靶向腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的治療應(yīng)運(yùn)而生，有效抑制包括胃癌在內(nèi)的惡性腫瘤血管新生，可有效抑制惡性腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移，從而改善惡性腫瘤患者預(yù)后［9-10］。本研究中，低劑量的DHM不僅對(duì)體外血管生成具有顯著抑制效應(yīng)，還可以抑制體內(nèi)血管生成；雖然DHM對(duì)體內(nèi)胃癌生長(zhǎng)具有顯著延緩作用，但DHM并不能有效地降低Ki-67增殖指數(shù)，而DHM給藥后可明顯抑制體內(nèi)胃癌新生血管形成，因此，本研究顯示低劑量的DHM不能干擾腫瘤細(xì)胞惡性增殖，但能通過(guò)抑制新生血管形成從而造成腫瘤處于“饑餓”狀態(tài)，進(jìn)而達(dá)到延緩腫瘤生長(zhǎng)的作用，通過(guò)H-E染色觀察到DHM組腫瘤組織中出現(xiàn)大片細(xì)胞壞死的痕跡可以說(shuō)明這一點(diǎn)，表明抑制新生血管形成在低劑量DHM發(fā)揮抑制體內(nèi)胃癌生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮主導(dǎo)作用。

ERK作為一種脯氨酸導(dǎo)向的絲氨酸/蘇氨酸激酶，主要位于細(xì)胞質(zhì)中，在諸如生長(zhǎng)因子、激素、細(xì)胞因子、高糖和缺氧等刺激后發(fā)生磷酸化，磷酸化的ERK可進(jìn)入細(xì)胞核中，進(jìn)一步活化NF-κB及P70核蛋白體S6激酶，使得相鄰脯氨酸的絲氨酸/蘇氨酸發(fā)生磷酸化。磷酸化ERK在介導(dǎo)信號(hào)從細(xì)胞膜表面受體轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用，p-ERK可激活STATs、c-Myc、Jun、EIk-1、ATF2和Max等轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而對(duì)這些轉(zhuǎn)錄因子各自靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程產(chǎn)生影響，最終對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、分化和增殖等多種生理功能發(fā)揮調(diào)控作用［11-13］。VEGF作為一種在可由正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞合成分泌的細(xì)胞因子，在正常組織細(xì)胞中呈低水平表達(dá)，且表達(dá)水平較為恒定，但其在許多腫瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞新生的最重要調(diào)節(jié)因子。VEGFA作為VEGF家族中與血管新生關(guān)系最密切的一員，有研究表明，VEGFA在惡性腫瘤細(xì)胞中的異常表達(dá)與腫瘤肝轉(zhuǎn)移存在正相關(guān)性，同時(shí)與惡性腫瘤患者的預(yù)后呈明顯負(fù)相關(guān)。VEGFA在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)與ERK磷酸化水平關(guān)系密切，另外人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子可通過(guò)ERK信號(hào)通路上調(diào)腫瘤細(xì)胞中VEGFA的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤組織中血管生成［14-15］。在本研究中，DHM可抑制體外胃癌細(xì)胞中ERK的磷酸化水平，同時(shí)下調(diào)VEGFA在體內(nèi)外胃癌中的表達(dá)，同時(shí)在體外實(shí)驗(yàn)中，DHM對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響能被額外添加的VEGFA所逆轉(zhuǎn)，證實(shí)DHM主要通過(guò)下調(diào)VEGFA的表達(dá)從而發(fā)揮抑制血管新生抑制作用；而在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，DHM可在VEGFA存在的情況下有效抑制體內(nèi)血管生長(zhǎng)，這可能是因?yàn)轶w內(nèi)外環(huán)境的差異從而導(dǎo)致DHM作用效果的不同；除了ERK，還有諸如JNK和p38等多種信號(hào)通路可調(diào)控血管生成［16］，但在本研究條件下，低濃度DHM不能影響JNK和p38的磷酸化水平。因此，DHM可能通過(guò)抑制ERK/VEGFA信號(hào)通路抑制腫瘤血管生成，從而干擾腫瘤的惡性增殖。

新生血管生成需要大量血管生成因子參與調(diào)控，包括VEGFR，VEGF自腫瘤細(xì)胞分泌后與位于內(nèi)皮細(xì)胞表面的VEGFR結(jié)合，有助于內(nèi)皮細(xì)胞募集和血管通透，并通過(guò)調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的降解、分化、增殖和遷移等過(guò)程，在調(diào)節(jié)血管生成過(guò)程中發(fā)揮非常關(guān)鍵的效應(yīng)，最終促進(jìn)新血管的形成［17-18］，而VEGFA/VEGFR2是其中最重要的血管生成信號(hào)軸。本實(shí)驗(yàn)也觀察到DHM可有效抑制VEGFR2在HUVEC中的磷酸化水平，結(jié)合之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，從而表明DHM可能通過(guò)調(diào)控胃癌細(xì)胞中ERK信號(hào)通路，影響胃癌細(xì)胞VEGFA的表達(dá)，同時(shí)抑制VEGFR2在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞功能。

綜上所述，DHM在發(fā)揮抑制腫瘤血管新生過(guò)程中伴有ERK/VEGFA/VEGFR2通路的失活，但鑒于體外實(shí)驗(yàn)中額外添加的VEGFA可一定程度下逆轉(zhuǎn)DHM對(duì)HUVEC的影響，從而表明VEGFA可以通過(guò)其他信號(hào)通路促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能，所以還需要進(jìn)一步研究DHM發(fā)揮抗血管新生的作用機(jī)制，同時(shí)本次體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中DHM作用時(shí)間較短（2周），可能使實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生偏倚，還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)明確。但本次研究仍然為開(kāi)發(fā)低毒高效的抗癌藥物提供了新的思路，有望將DHM作為臨床胃癌化療的“補(bǔ)充選擇”。