王思雯，張珺，馬君，張璐

吸煙是影響多種疾病發(fā)生的風(fēng)險因素，包括肺癌、高血壓、動脈硬化、胃部疾病和腦部疾病。尼古?。╪icotine）又名煙堿，是煙草中的主要有害成分之一，會直接引起肺細(xì)胞凋亡損傷，近年來有研究發(fā)現(xiàn)尼古丁會直接影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長，誘發(fā)心腦血管疾病，但是尼古丁對血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響效果和機制尚不明確[1-3]。JAK/STAT信號通路是一種快速傳遞的信號通路，參與激活各種細(xì)胞因子與受體結(jié)合并參與細(xì)胞的增殖、凋亡和分化[4]。本次研究主要分析尼古丁對人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）的影響以及對JAK/STAT通路的影響，探究尼古丁對血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料HUVECs購自ATCC（美國）。MEM培養(yǎng)基以及胎牛血清購自Gibco（美國）。尼古丁購自Sigma（美國）。CCK-8試劑盒和凋亡試劑盒購自Dojindo（日本）。酶標(biāo)儀型號ELX 800，公司為Bio-Teck（美國）。流式細(xì)胞儀購自BD公司（美國）。JAK、p-JAK、STAT、p-STAT、Bax、Bcl-2和Caspase-3一抗體和二抗均來自Abcam公司（美國）。PVDF膜（Bio-Rad，美國）。PCR引物由Genewiz（蘇州，中國）設(shè)計和合成。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒TaKaRa和SYBR Prellix Ex TaqTM實時PCR試劑盒購自TaKaRa（日本）。

1.2 細(xì)胞分組與培養(yǎng)HUVECs在含有10%的胎牛血清的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃，5%的CO2，相對濕度95%。將細(xì)胞分為對照組、尼古丁1組、尼古丁2組、尼古丁3組，分別在培養(yǎng)基中加入終濃度為0、10-8、10-7、10-6mol/L的尼古丁，培養(yǎng)24 h。

1.3 檢測方法

1.3.1 顯微鏡觀察在培養(yǎng)48 h后，使用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3.2 CCK-8檢測細(xì)胞活力CCK-8法被應(yīng)用于測定細(xì)胞活力。將細(xì)胞接種于96孔板，加入10 μl CCK-8試劑并在37℃，5%的CO2中培養(yǎng)4 h。使用酶標(biāo)儀測量每個孔在450 nm處的吸光度（OD）。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞術(shù)用于檢測細(xì)胞凋亡情況，細(xì)胞洗滌、重懸后分別按照試劑盒說明書加入試劑，通過流式細(xì)胞儀檢測凋亡率。

1.3.4 Western blot使用Western Blot檢測細(xì)胞中JAK、p-JAK、STAT、p-STAT蛋白水平。在液氮的保護下裂解細(xì)胞，在12000 rpm，4℃下離心15 min收集上清液，使用BCA方法確定蛋白質(zhì)濃度。使用10%的SDS-PAGE凝膠用于電泳，電泳后使用PVDF膜轉(zhuǎn)膜并在室溫下用5%無脂牛奶封閉2 h。加入一抗室溫震蕩2 h，后在4℃孵育過夜，加入二抗。使用GAPDH作為內(nèi)參。

1.3.5 PCR使用PCR法檢測Bax、Bcl-2和Caspase-3 mRNA表達。細(xì)胞裂解后收集總RNA，通過在95℃下激活DNA聚合酶5 min進行PCR，然后進行40個循環(huán)（95℃/10 s和60℃/30 s），最終延伸72℃下10 min，保持在4°C，GAPDH作為內(nèi)參，使用2-ΔΔCT法分析mRNA水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理實驗數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）表示。統(tǒng)計分析使用SPSS 19（SPSS，Inc.，Chicago，IL，USA）。進行單因素方差分析（ANOVA）以評估實驗組之間的差異。統(tǒng)計學(xué)顯著性表示為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 尼古丁對細(xì)胞形態(tài)的影響使用顯微鏡觀察尼古丁對細(xì)胞形態(tài)的影響，結(jié)果顯示對照組和尼古丁1組中內(nèi)皮細(xì)胞呈現(xiàn)多邊形，胞漿豐富，邊界清晰，并且細(xì)胞排列緊密，呈現(xiàn)鋪路石狀態(tài)。而尼古丁2組細(xì)胞出現(xiàn)輕微的萎縮，排列緊密度降低，尼古丁3組的細(xì)胞呈現(xiàn)萎縮狀態(tài)（圖1）。

2.2 尼古丁對細(xì)胞活力的影響在干預(yù)后12 h和24 h，尼古丁可劑量依賴性的抑制HUVECs活力（表1）。

2.3 尼古丁對細(xì)胞凋亡的影響尼古丁可以劑量依賴性的促進HUVECs凋亡（表2、圖1）。

2.4 尼古丁對JAK/STAT通路的影響尼古丁可顯著抑制p-JAK/t-JAK和p-STAT/t-STAT的水平（表3和圖2）。

2.5 尼古丁對Bax、Bcl-2和Caspase-3 mRNA的影響尼古丁可顯著的提高Caspase-3和Bax mRNA的水平，抑制Bcl-2 mRNA的水平（表4）。

表1 尼古丁細(xì)胞活力的影響

表2 尼古丁對細(xì)胞凋亡的影響（%）

圖1 干預(yù)后24 h流式細(xì)胞術(shù)檢測尼古丁對細(xì)胞凋亡的影響

表3 尼古丁對JAK/STAT通路的影響

圖2 干預(yù)后24h Western blot檢測尼古丁對細(xì)胞凋亡的影響

表4 尼古丁對Bax、Bcl-2和Caspase-3 mRNA的影響

3 討論

心腦血管疾病是影響人類健康的重大疾病，調(diào)查顯示在全世界范圍內(nèi)，每年死于心腦血管疾病的人數(shù)超過1500萬人。我國是心腦血管疾病大國，而吸煙是引起心腦血管疾病的主要誘因之一[5]。研究發(fā)現(xiàn)吸煙患者的冠心病的發(fā)病率顯著高于不吸煙者，吸煙不但會提高血液的黏度，還會引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷，引起血管內(nèi)皮功能異常，引起高血壓、冠心病、腦梗死等的發(fā)病風(fēng)險[6]。

研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)尼古丁會直接影響肺功能并引起肺損傷[7]。尼古丁在進入集體后會經(jīng)由血液輸送，直接影響血管、心臟以及腦血管，作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，直接影響血管內(nèi)皮功能。為分析尼古丁對血管的影響，我們使用HUVECs作為研究對象，研究不同尼古丁濃度對細(xì)胞的影響。結(jié)果顯示在高濃度的尼古丁影響下，HUVECs形態(tài)發(fā)生變化，出現(xiàn)萎縮，并且細(xì)胞間排列不緊密。并且進一步的研究結(jié)果也顯示尼古丁可以劑量依賴性的抑制細(xì)胞HUVECs活力，促進HUVECs的凋亡。國內(nèi)有研究顯示尼古丁會通過調(diào)節(jié)自噬影響血管內(nèi)皮細(xì)胞功能[8]。吳雨徑等[9]研究也發(fā)現(xiàn)尼古丁可以抑制HUVECs增殖。國外也有研究顯示尼古丁可通過Akt通路誘導(dǎo)HUVECs凋亡[10]。這提示尼古丁會降低HUVECs的活力并誘導(dǎo)其凋亡。

為進一步研究尼古丁影響HUVECs的機制，我們分析不同尼古丁濃度下培養(yǎng)24 h后JAK/STAT通路和凋亡蛋白的影響。JAK受到環(huán)境或其他刺激被激活后，使STAT的酪氨酸磷酸化，并且STAT會進入細(xì)胞核直接調(diào)節(jié)靶基因的表達[11]。JAK/STAT通路的激活會直接促進促凋亡蛋白Caspase-3和Bax的表達并抑制Bcl-2 的表達[12]。本次研究結(jié)果顯示尼古丁可顯著的抑制HUVECs的p-JAK/t-JAK和p-STAT/t-STAT的水平，并且尼古丁可顯著的提高Caspase-3和Bax mRNA的水平，抑制Bcl-2 mRNA的水平。國內(nèi)有研究顯示HUVECs損傷與JAK/STAT通路的抑制有關(guān)，并且提高JAK/STAT的水平可減少HUVECs損傷[13]。國外也有研究顯示高糖會通過抑制JAK2/STAT3的水平引起HUVECs損傷[14]。Hu等[15]的研究也得到了相似的結(jié)果。這提示尼古丁可能通過抑制JAK/STAT通路磷酸化的水平促進Caspase-3和Bax并抑制Bcl-2的水平，誘導(dǎo)HUVECs凋亡。

綜上所述，尼古丁可能通過下調(diào)JAK/STAT通路調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達，抑制HUVECs活力并促進其凋亡。這可能與吸煙引起心腦血管疾病有關(guān)，但是關(guān)于其具體的影響機制還需要進一步的研究。