李北寧，于娟

慢性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎（chronic lymphocytic thyroiditis，CLT）又被稱為橋本甲狀腺炎，是臨床上常見的自身免疫性疾?。?］。其以甲狀腺組織中不同程度的T、B 淋巴細(xì)胞浸潤、濾泡細(xì)胞破壞為特征［2］。近年來CLT 的發(fā)病率在不斷增加，其中尤以女性多見，給病人的身心健康帶來了嚴(yán)重的傷害。細(xì)胞自噬在免疫性疾病中扮演著重要角色，是細(xì)胞利用溶酶體降解自身受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的過程，這一特定的過程是細(xì)胞存活、分化、發(fā)育以及維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要機(jī)制，在生理和病理過程中較為常見［3］。盡管大量研究結(jié)果顯示，自噬在多種自身免疫性疾病中發(fā)揮重要致病作用，但是自噬在CLT中的致病機(jī)制未見報(bào)道。甲狀腺濾泡細(xì)胞是甲狀腺素（T4）合成的重要場所，主要將甲狀腺細(xì)胞中合成的甲狀腺球蛋白（Tg）吞入胞內(nèi)，在蛋白水解酶作用下釋放T4 和三碘甲狀腺原氨酸（T3），進(jìn)入血液［4］。CLT病理變化特征之一即甲狀腺濾泡細(xì)胞破壞，且近年來越來越多的研究關(guān)注甲狀腺濾泡細(xì)胞在CLT 發(fā)病過程中的作用。有研究表明，外周血單個核細(xì)胞中干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）在自身免疫性甲狀腺疾病和正常對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［5］，但在甲狀腺組織局部IFN-γ 的表達(dá)尚無相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。故本研究旨在探討IFN-γ是否對甲狀腺濾泡細(xì)胞自噬參與CLT 具有調(diào)控作用，IFN-γ 是否可以調(diào)控甲狀腺細(xì)胞自噬，從而導(dǎo)致甲狀腺功能低下，以期深入了解IFN-γ 在CLT 發(fā)生和發(fā)展中的作用及意義。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上以甲狀腺濾泡細(xì)胞為依托，觀察自噬在CLT 中的作用。并提出兩個假設(shè)：（1）CLT中甲狀腺濾泡細(xì)胞自噬活性升高/降低；（2）炎癥細(xì)胞因子IFN-γ 對甲狀腺濾泡細(xì)胞自噬有誘導(dǎo)/抑制作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2018 年1—7 月，收集新疆喀什地區(qū)第二人民醫(yī)院24 例CLT 手術(shù)切除病人的甲狀腺組織標(biāo)本作為CLT組，以及24例單純甲狀腺腫（Simple Goiter，SG）手術(shù)切除病人的甲狀腺組織作為SG組（均經(jīng)病理證實(shí)）。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求，并得到病人知情同意。離體后半小時內(nèi)立即進(jìn)行處理并用于分析。兩組受試者性別（SG 組：男/女＝12/12；CLT 組：男/女＝11/13）、年齡［SG 組：（45.72±5.23）歲；CLT 組：（46.89±6.15）歲］差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），故排除上述因素對試驗(yàn)結(jié)果造成的影響，數(shù)據(jù)具有可比性。

自噬相關(guān)抗體兔抗微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC-3）抗體、兔抗哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）抗體、兔抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cysteine-aspartic acid protease-3，caspase-3）抗體，兔抗β-肌動蛋白（β-actin）抗體均購于Cell Signaling 公司。RPMI1640 培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購于Gibco 公司。辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗兔抗體購于圣克魯斯生物技術(shù)公司（Santa Cruz 公司）。全蛋白提取試劑盒購于默克密里博公司。

1.2 研究方法

1.2.1 分離、培養(yǎng)、鑒定人甲狀腺濾泡細(xì)胞 常規(guī)甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/mL，分成6組接種于24孔培養(yǎng)板上（每組復(fù)孔4個），每孔加入細(xì)胞懸液0.5 mL。置于含有100 mL/L胎牛血清的培養(yǎng)基中（含有100 IU/mL青霉素和100 μg/mL 鏈霉素），37 ℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，觀察細(xì)胞貼壁后繼續(xù)培養(yǎng)3 d，隔日換液1 次，去除未貼壁的甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞。1 000 r/mim 離心5 min，倒去上清液，得到細(xì)胞沉淀。上清液置于4 ℃冰箱保存待測，沉淀于倒置顯微鏡觀察。

1.2.2 CLT、SG 病人血液收集 手術(shù)切除甲狀腺組織前一周，抽取病人血液1mL，置室溫下靜置2 h后，于4 ℃離心機(jī)中3 000 r/min，離心10 min，吸取上清液，置于4 ℃冰箱待測。

1.2.3 流式細(xì)胞技術(shù)檢測甲狀腺濾泡細(xì)胞CD3+占比 病人甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞經(jīng)1.2.2處理后，吸去培養(yǎng)液后用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌3遍，刮下貼壁細(xì)胞，加入少許PBS液移入離心管，1 500 r/min，離心30 min，吸棄上清留取細(xì)胞團(tuán)塊。加入染色緩沖液（Staining Buffer）1 mL 重懸沉淀，以1 200 r/min 離心5 min，棄去上清液，再加100 mL Staining Buffer重懸，即得甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞懸液。于細(xì)胞懸液中加入1 mL CD3-APC 抗體，避光孵育30 min；1 200 r/min，離心5 min，棄去上清，得細(xì)胞沉淀；后加入1 mL Staining Buffer 重懸沉淀，重復(fù)上述步驟后，200 mL Staining Buffer重懸，于冰上備用待上機(jī)檢測。

1.2.4 三碘甲狀腺原氨酸（T3）、甲狀腺素（T4）、甲狀腺球蛋白（Tg）、IFN-γ 及環(huán)磷酸腺苷（cAMP）測定 取出1.2.1 處理的甲狀腺濾泡細(xì)胞和1.2.2 處理的SG 病人血液；采用放射性免疫法測定培養(yǎng)液中T3、T4 及Tg；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）測定培養(yǎng)液中IFN-γ及cAMP。嚴(yán)格按照說明書操作，每組測10個復(fù)孔，取平均值。ELISA試劑盒購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測自噬相關(guān)蛋白Becline、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ（LC3B-Ⅱ）、mTOR蛋白的表達(dá) 病人甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞經(jīng)3 g/L 胰蛋白酶消化后，加入2 倍體積的PBS 吹打，250 r/min，離心5 min，重復(fù)洗滌3次。按照107/mL的比例加入細(xì)胞裂解液充分裂解，5 000 r/min，離心20 min，取上清進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）上；50 g/L 牛血清白蛋白，37 ℃封閉1 h，加入兔抗人Becline抗體（1∶1 000），兔抗人mTOR 抗體（1∶1 000）、兔抗人LC3 抗體（1∶1 000）、兔抗人β-actin（1∶1 000）抗體，4 ℃搖床輕微震蕩孵育過夜；等滲緩沖鹽溶液（TBST）洗滌后，再加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1∶5 000），37 ℃震蕩孵育1 h；TBST 洗滌后，ECL 曝光顯影鑒定。用AlphaView 圖像分析軟件分析，計(jì)算各蛋白條帶的吸光度值，以目的蛋白與內(nèi)參的吸光度比值表示其蛋白表達(dá)水平。

1.2.6 不同濃度的IFN-γ對甲狀腺濾泡細(xì)胞自噬調(diào)控作用的觀測設(shè)計(jì) 待病人甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)期，分別用不同濃度的IFN-γ（250、500、1 000 U/mL）處理24 h，設(shè)為IFN-γ刺激組，未經(jīng)IFNγ作用的甲狀腺濾泡細(xì)胞，設(shè)為對照組，收集細(xì)胞用于后期檢測。蛋白質(zhì)印跡法法檢測自噬標(biāo)志蛋白Becline、LC3B-Ⅱ、mTOR表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究中數(shù)據(jù)全部采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行處理。計(jì)量資料采用表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或單因素方差分析+組間兩兩比較LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 分離、培養(yǎng)、鑒定人甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞 成功分離出人甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察，可見人甲狀腺濾泡細(xì)胞在貼壁之前呈圓形或橢圓形或不規(guī)則形狀，CLT 病人組織切片可見多個淋巴生發(fā)中心，大量淋巴細(xì)胞浸潤，甲狀腺濾泡細(xì)胞萎縮。SG 病人甲狀腺組織甲狀腺濾泡細(xì)胞未見明顯炎癥浸潤。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測甲狀腺濾泡細(xì)胞CD3+占比流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示，CLT 組甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞內(nèi)浸潤的CD3+淋巴細(xì)胞數(shù)所占百分比（25.76±4.05）%明顯高于SG 組（10.35±4.21）%，兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

2.3 T3、T4、Tg、IFN-γ 及cAMP 測定結(jié)果 甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞與血清T3、T4、Tg、INF-γ 及cAMP水平測定結(jié)果如下，由下表可見與SG 組比較，CLT組中T3、T4、Tg、INF-γ 及cAMP 水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1，2。

表1 慢性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎（CLT）組與單純甲狀腺腫（SG）組甲狀腺組織中三碘甲狀腺原氨酸（T3）、甲狀腺素（T4）、甲狀腺球蛋白（Tg）、干擾素-γ（IFN-γ）及環(huán)磷酸腺苷（cAMP）水平/

表1 慢性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎（CLT）組與單純甲狀腺腫（SG）組甲狀腺組織中三碘甲狀腺原氨酸（T3）、甲狀腺素（T4）、甲狀腺球蛋白（Tg）、干擾素-γ（IFN-γ）及環(huán)磷酸腺苷（cAMP）水平/

表2 慢性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎（CLT）組與單純甲狀腺腫（SG）組血清三碘甲狀腺原氨酸（T3）、甲狀腺素（T4）、甲狀腺球蛋白（Tg）、干擾素-γ（IFN-γ）及環(huán)磷酸腺苷（cAMP）水平/

表2 慢性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎（CLT）組與單純甲狀腺腫（SG）組血清三碘甲狀腺原氨酸（T3）、甲狀腺素（T4）、甲狀腺球蛋白（Tg）、干擾素-γ（IFN-γ）及環(huán)磷酸腺苷（cAMP）水平/

2.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測Becline、LC3B-Ⅱ、mTOR蛋白的表達(dá) 蛋白質(zhì)印跡法對24例CLT及24例SG甲狀腺組織中Becline、LC3B-Ⅱ、mTOR 蛋白表達(dá)水平檢測，結(jié)果顯示CLT組織與SG組織相比自噬水平低下，表現(xiàn)為Becline，LC3B-Ⅱ蛋白低表達(dá)，mTOR蛋白高表達(dá)。見表3，圖1。

表3 慢性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎（CLT）組與單純甲狀腺腫（SG）組自噬相關(guān)蛋白Becline、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ（LC3B-Ⅱ）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的表達(dá)/

表3 慢性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎（CLT）組與單純甲狀腺腫（SG）組自噬相關(guān)蛋白Becline、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ（LC3B-Ⅱ）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的表達(dá)/

圖1 蛋白質(zhì)印跡法檢測慢性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎（CLT）組與單純甲狀腺腫（SG）組自噬相關(guān)蛋白Becline、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ（LC3B-Ⅱ）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的表達(dá)

2.5 不同濃度的IFN-γ 對甲狀腺濾泡細(xì)胞自噬蛋白影響 分別用不同濃度IFN-γ（250、500、1 000 U/mL）處理甲狀腺濾泡細(xì)胞24 h，蛋白質(zhì)印跡法檢測甲狀腺濾泡細(xì)胞Becline，LC3B-Ⅱ，mTOR 蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示IFN-γ 干預(yù)后，甲狀腺濾泡細(xì)胞中自噬蛋白Becline，mTOR，LC3B-Ⅱ被誘導(dǎo)，表現(xiàn)為Becline，LC3B-Ⅱ水平高表達(dá)，mTOR水平低表達(dá)，且隨著IFN-γ濃度的增加，誘導(dǎo)作用愈明顯。見圖2，表4。

圖2 蛋白質(zhì)印跡法檢測不同濃度的干擾素-γ（IFN-γ）對慢性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎（CLT）濾泡細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Becline、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ（LC3B-Ⅱ）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）表達(dá)

表4 不同濃度的干擾素-γ（IFN-γ）對慢性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎（CLT）濾泡細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Becline、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ（LC3B-Ⅱ）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）表達(dá)影響/

表4 不同濃度的干擾素-γ（IFN-γ）對慢性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎（CLT）濾泡細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Becline、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ（LC3B-Ⅱ）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）表達(dá)影響/

注：與IFN-γ未干預(yù)組（0 U/mL組）CLT比較，aP＜0.05，bP＜0.01

3 討論

自身免疫性甲狀腺疾病包括毒性彌漫性甲狀腺腫（Graves ?。┖虲LT，以產(chǎn)生抗促甲狀腺激素受體抗體（TSHR-Ab）、抗甲狀腺球蛋白抗體（TG-Ab）等自身抗體為特征，但確切的機(jī)制并不十分清楚［6-7］。已有文獻(xiàn)報(bào)道Th1 型淋巴細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子是CLT 的重要致病因素［8-9］。亦有研究表明自噬在營養(yǎng)缺乏、低氧應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、藥物誘導(dǎo)時出現(xiàn)，在自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用，對細(xì)胞自我更新和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持起重要作用［10］。本研究在于探討自噬對CLT的作用及Th1細(xì)胞炎性因子IFN-γ對自噬介導(dǎo)CLT的調(diào)控作用。結(jié)果成功分離鑒定出人甲狀腺濾泡細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測到與SG 相比，CLT 組織中CD3+T 淋巴細(xì)胞數(shù)顯著升高；CLT甲狀腺濾泡細(xì)胞及血清中T3、T4、Tg、Th1細(xì)胞因子IFN-γ、cAMP 水平顯著升高；與SG 組相比，Hashimo 甲狀腺炎甲狀腺濾泡細(xì)胞自噬水平低下，表現(xiàn)為Becline、LC3B-Ⅱ蛋白低表達(dá)，mTOR 蛋白高表達(dá)；IFN-γ可誘導(dǎo)甲狀腺濾泡細(xì)胞自噬增加，表現(xiàn)為上述3 種自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的逆轉(zhuǎn)，且這種逆轉(zhuǎn)作用與IFN-γ呈濃度依賴性。由此可見甲狀腺濾泡細(xì)胞自噬參與CLT 的發(fā)展，且作用機(jī)制可能與炎性因子IFN-γ有關(guān)。

Becline 和LC3 與自噬體的形成有關(guān)，測定自噬相關(guān)基因Becline和LC3B的表達(dá)廣泛用于檢測自噬體的數(shù)量，且可靠性較高［11-13］。但目前對于CLT 中自噬相關(guān)基因Becline，LC3 的研究還未見報(bào)道。mTOR與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)代謝以及能量、生長因子等信號整合相關(guān)。自噬作為細(xì)胞物質(zhì)代謝的方式之一，mTOR在其調(diào)節(jié)中占據(jù)重要的位置，參與調(diào)控自噬的主要通路，具有“門控”作用［14］。Pattingre S 等［15］團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)能量或營養(yǎng)物質(zhì)缺乏時，mTOR的活性會受到抑制，自噬水平升高以改善細(xì)胞能量狀態(tài)；反之能量或營養(yǎng)充足時，mTOR被激活，自噬通路受阻，自噬水平下調(diào)。Meijer AJ等［16］研究表明活化的mTOR 能夠減少自噬泡的形成。本研究結(jié)果顯示，CLT 組Becline 和LC3B-Ⅱ的表達(dá)較對照組降低，mTOR表達(dá)較對照組升高，與文獻(xiàn)［17］報(bào)道一致。

IFN-γ 是一種多功能的細(xì)胞因子，具有強(qiáng)效促炎作用，在多種疾病中顯著增加，并且與疾病的發(fā)生發(fā)展有緊密聯(lián)系［18-20］。有研究表明IFN-γ 可以增強(qiáng)甲狀腺上皮細(xì)胞HLA-Ⅱ類抗原的表達(dá)，觸發(fā)自身免疫的發(fā)生，激活并趨化大量的單核T 淋巴細(xì)胞進(jìn)入甲狀腺內(nèi)，增強(qiáng)細(xì)胞毒性作用，促進(jìn)自身抗體的產(chǎn)生。本研究結(jié)果顯示，CLT 組織中CD3+T 淋巴細(xì)胞表達(dá)顯著增加，且甲狀腺濾泡細(xì)胞及血清中IFN-γ表達(dá)亦顯著升高，提示Th1細(xì)胞分化上調(diào)。

IFN-γ 不僅具有較強(qiáng)的促炎作用，還是一種強(qiáng)效的細(xì)胞自噬誘導(dǎo)因子，能夠誘導(dǎo)多種細(xì)胞的自噬活化，但是IFN-γ 對CLT 甲狀腺濾泡細(xì)胞的自噬活性還未見報(bào)道。本研究結(jié)果顯示IFN-γ可誘導(dǎo)CLT甲狀腺濾泡細(xì)胞的活化，在CLT 中扮演重要角色。推測IFN-γ 抑制劑可能成為CLT 治療靶標(biāo)，但還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究探討了CLT 中自噬表達(dá)及IFN-γ誘導(dǎo)CLT甲狀腺濾泡細(xì)胞自噬的作用，為CLT進(jìn)一步研究提供了基礎(chǔ)。但是IFN-γ誘導(dǎo)CLT甲狀腺濾泡細(xì)胞自噬并不清楚，后期還需進(jìn)一步研究。