張玉玲，梁 艷，俞 鐘，林傳明，李海亮

(1.南康區(qū)第一人民醫(yī)院腫瘤血液科；2.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院血液科，江西 贛州 341000)

白血病是一類起源于造血干細(xì)胞(hematopoietic progenitor cells，HPCs)和祖細(xì)胞的造血系統(tǒng)惡性增殖性疾病，其非實(shí)體瘤的特性決定了治療方法以化學(xué)治療為主，但大多數(shù)化療藥物有不同程度的造血系統(tǒng)毒性，且多數(shù)化療藥物在常規(guī)劑量?jī)?nèi)即可引起骨髓抑制。本研究運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,FCM)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)成人AL患者發(fā)病時(shí)及化療后外周血T淋巴細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞，了解AL患者發(fā)病時(shí)免疫狀態(tài)，了解AL患者隨著化療次數(shù)的增加免疫抑制是否加重。

1 材料與方法

1.1病例資料實(shí)驗(yàn)組為成人AL患者共47例，AML患者35例，ALL患者12例，年齡13～75歲，中位年齡43歲，診斷符合張之南《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》。47例患者從初診時(shí)開始跟蹤數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，但因?yàn)榛颊咭缽男圆煌?，其?9例在初診時(shí)進(jìn)行了檢測(cè)，19例患者在第1次化療后進(jìn)行了檢測(cè)，17例患者在第2次化療后進(jìn)行了檢測(cè)，21例患者在第3次化療后進(jìn)行了檢測(cè)，13例患者在第4次化療后進(jìn)行了檢測(cè)，10例患者在第五次化療后進(jìn)行了檢測(cè)。所有AL患者不伴有其他腫瘤性疾病、免疫性疾病。對(duì)照組為22例醫(yī)院健康體檢者，無(wú)自身免疫性疾病、造血系統(tǒng)疾病、腫瘤性疾病，6個(gè)月內(nèi)未使用過(guò)糖皮質(zhì)激素等免疫抑制劑，男11例，女11例，年齡18～65歲，中位年齡42歲。

1.2實(shí)驗(yàn)器材與試劑

1.2.1實(shí)驗(yàn)試劑FACSTM紅細(xì)胞裂解液，規(guī)格200 t，購(gòu)自美國(guó)BD公司。

鼠抗人CD3-FITC/CD16+56-PE/CD45-PerCP、CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4-APC標(biāo)記熒光抗體，規(guī)格50 t，購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2.2實(shí)驗(yàn)儀器BD FACS Calibur型流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Becton Dickinson公司。XN2000全自動(dòng)血液分析儀購(gòu)自日本Sysmex有限公司。

1.3標(biāo)本采集及處理所有患者進(jìn)MICM分型后，根據(jù)指南進(jìn)行規(guī)范化療。分別在AL患者發(fā)病時(shí)及化療后2～3周空腹靜脈抽取外周血5 mL，其中肝素抗凝2 mL，EDTA-K2抗凝3 mL，在2 h內(nèi)送檢。

1.4運(yùn)用FCM檢測(cè)T細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞百分比取兩支流式專用管，分別標(biāo)記上1、2號(hào)，在1號(hào)試管中加入鼠抗人CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4-APC熒光抗體8 μL，在2號(hào)試管中加入鼠抗人CD3-FITC/CD16+56-PE/CD45-PerCP熒光抗體8 μL，再各加入肝素抗凝全血60 μL，充分混勻，室溫下避光孵育15 min；然后往兩支試管中各加入紅細(xì)胞裂解液600 μL，室溫下避光孵育15 min，然后離心5 min，轉(zhuǎn)速1 600 r·min-1；去除上清液，加入1.0 mL PBS，混勻后離心5 min，轉(zhuǎn)速1 600 r·min-1；加 PBS 0.5 mL混勻后，采用BD FACSCaliburTMFlow Cytometer測(cè)定T細(xì)胞、NK細(xì)胞百分比。所有受檢者標(biāo)本都用同一閾值、補(bǔ)償、電壓等條件檢測(cè)。兩試管各收集淋巴細(xì)胞10 000個(gè)。

1.5T細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞數(shù)量測(cè)定采用Sysmex XN2000血液分析儀計(jì)算成人AL患者和健康對(duì)照組外周血淋巴細(xì)胞數(shù)量，然后用所測(cè)的淋巴細(xì)胞數(shù)量乘以FCM所檢測(cè)的T細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞百分比。

2 結(jié) 果

2.1成人AL患者外周血NK、T細(xì)胞百分比比較表1顯示，成人AL患者化療后外周血NK細(xì)胞百分比有下降趨勢(shì)，至第5次化療后降至(12.67±7.49)%，組間NK細(xì)胞百分比比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.038)。成人AL患者初診時(shí)、多次(第1至第5次)化療后、未緩解時(shí)(指的是第1次化療未緩解時(shí)且這部分患者之后不再歸入實(shí)驗(yàn)組)，外周血NK細(xì)胞百分比相對(duì)于健康人群更低(P<0.05)。成人AL患者化療后外周血T細(xì)胞百分比較初診時(shí)上升，組間比較差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。成人AL患者初診時(shí)、多次(第1至第5次)化療后、健康對(duì)照組外周血NK細(xì)胞百分比均高于成人AL未緩解患者(P<0.05)。成人AL患者第2至第5次化療后外周血T細(xì)胞百分比相對(duì)于健康對(duì)照組及初診患者更低(P<0.05)(見表1)。T細(xì)胞百分比與化療次數(shù)呈正相關(guān)(r=0.396，P<0.01)。

第6次化療患者8例，化療后AL患者NK、T細(xì)胞百分比分別為(17.20±5.72)%、(75.63±7.96)%。第7次化療患者4例，化療后AL患者NK、T細(xì)胞百分比分別為(11.87±2.38)%、(79.59±2.13)%。

表1 成人AL患者外周血NK、T細(xì)胞百分比比較

注：與健康對(duì)照組比較，*P<0.05；與NR組比較，

#P<0.05；與初診時(shí)比較，△P<0.05。

2.2成人AL患者外周血NK、T細(xì)胞數(shù)量比較表2顯示，成人AL患者第5次化療后NK細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)降為(0.11±0.04)×109·L-1。8組NK細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量之間有明顯差異(P<0.05)。成人AL患者初診時(shí)、化療后、未緩解時(shí)的外周血NK細(xì)胞數(shù)量相對(duì)于對(duì)照組[(0.40±0.23)×109·L-1]更低(P<0.05)。8組T淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表2)。NK細(xì)胞絕對(duì)數(shù)與化療次數(shù)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.29，P=0.004)。

第6次化療患者8例，化療后AL患者NK、T細(xì)胞數(shù)量分別為(0.16±0.09)×109·L-1、(0.71±0.28)×109·L-1。第7次化療患者4例，化療后AL患者NK、T細(xì)胞數(shù)量分別為(0.11±0.07)×109·L-1、(0.68±0.36)×109·L-1。

表2 成人AL患者外周血NK、T細(xì)胞數(shù)量比較

注：與健康對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.3成人AL患者外周血T細(xì)胞亞群百分比比較表3顯示，成人AL患者初診時(shí)、化療后、未緩解患者、對(duì)照組CD4+T細(xì)胞百分比、DNT細(xì)胞百分比、CD4+T細(xì)胞/CD8+T細(xì)胞比值無(wú)差異(P>0.05)。CD8+T細(xì)胞百分比與化療次數(shù)呈正相關(guān)(r=0.259，P=0.01)。

成人AL患者初診時(shí)、化療后、未緩解患者的外周血CD8+T細(xì)胞百分比相對(duì)健康對(duì)照組外周血CD8+T細(xì)胞百分比[(23.36±6.87)%]更低(P=0.02)(見表3)。

成人AL患者初診時(shí)、化療后、未緩解患者的外周血DPT細(xì)胞百分比相對(duì)于健康對(duì)照組外周血DPT細(xì)胞百分比[(0.51±0.32)%]更低(P=0.009)(見表3)。

第6次化療患者8例，化療后AL患者CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、DPT細(xì)胞、DNT細(xì)胞百分比分別為(34.70±4.39)%、(33.00±5.7)%、(1.02±0.57)%、(6.90±2.68)%。

第7次化療患者4例，化療后AL患者CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、DPT細(xì)胞、DNT細(xì)胞百分比分別為(37.19±3.62)%、(33.98±4.24)%、(1.87±2.06)%、(7.46±2.28)%。

2.4成人AL患者外周血T細(xì)胞亞群數(shù)量比較成人AL患者初診時(shí)、多次化療(第1至第5次)后、未緩解的患者、對(duì)照組CD4+T細(xì)胞數(shù)量、CD8+T細(xì)胞數(shù)量、DPT細(xì)胞數(shù)量、DNT細(xì)胞數(shù)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表4)。

第6次化療患者8例，化療后AL患者CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、DPT細(xì)胞、DNT細(xì)胞數(shù)量分別為(0.32±0.11)×109·L-1、(0.32±0.15)×109·L-1、(0.009 9±0.005 8)×109·L-1、(0.060±0.040)×109·L-1。第7次化療患者4例，化療后AL患者CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、DPT細(xì)胞、DNT細(xì)胞數(shù)量分別為(0.31±0.16)×109·L-1、(0.30±0.17)×109·L-1、(0.010 0±0.004 6)×109·L-1、(0.065±0.404)×109·L-1。

表3 成人AL患者外周血T細(xì)胞亞群百分比比較

注：與健康對(duì)照組比較，*P<0.05。

表4 成人AL患者不同時(shí)期外周血T細(xì)胞亞群數(shù)量

3 討 論

白血病既抑制正常造血，又影響免疫系統(tǒng)。免疫系統(tǒng)組成部分之一的淋巴細(xì)胞，在抗實(shí)體瘤、白血病過(guò)程當(dāng)中承擔(dān)關(guān)鍵性的角色。

NK細(xì)胞只出現(xiàn)在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，約占人外周血單個(gè)核細(xì)胞的15%，其在宿主防御過(guò)程中起著非常重要的作用。我們研究發(fā)現(xiàn)成人AL患者初診時(shí)的NK細(xì)胞百分比、數(shù)量均相對(duì)于健康人群更低，說(shuō)明AL患者初診時(shí)就存在NK細(xì)胞免疫缺陷，這與張司琪、孔令君、孫鴻麗等[1-3]研究結(jié)果一致。我們的實(shí)驗(yàn)表明化療1～5次后，NK細(xì)胞百分比、數(shù)量仍低于健康對(duì)照組，提示殺死了大部分白血病細(xì)胞后，NK細(xì)胞水平仍未恢復(fù)正常，這可能是藥物、白血病細(xì)胞的抑制作用、營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)等多種因素導(dǎo)致，NK細(xì)胞何時(shí)恢復(fù)正常水平，需要延長(zhǎng)觀察時(shí)間進(jìn)一步分析。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)未緩解患者的NK細(xì)胞百分比、數(shù)量均低于健康人群，且百分比明顯低于初診患者及化療后緩解患者，說(shuō)明未緩解患者NK細(xì)胞免疫缺陷，且比初診時(shí)更嚴(yán)重。

T細(xì)胞作為特異性免疫細(xì)胞在抗腫瘤免疫應(yīng)答中起重要的作用，但在不少腫瘤患者中，T細(xì)胞功能異常、各亞群分布紊亂[4-6]。研究表明T細(xì)胞上的PD-1表達(dá)增加[7]。理論上白血病細(xì)胞負(fù)荷大時(shí)T細(xì)胞上PD-1與白血病細(xì)胞上的PD-L1結(jié)合導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，T細(xì)胞數(shù)量減少。而本實(shí)驗(yàn)表明成人AL患者初診時(shí)外周血T細(xì)胞百分比、數(shù)量與健康人群比較無(wú)差別，說(shuō)明成人AL患者的T細(xì)胞在絕對(duì)數(shù)方面受影響不大，但不排除功能改變的可能，這結(jié)果與張司琪、孔令君、孫鴻麗等[1-3]研究結(jié)果不一致，這與本實(shí)驗(yàn)所選的健康對(duì)照組的T細(xì)胞百分比(64.98±10.68)%較低有關(guān)，張司琪、孔令君、孫鴻麗等研究的健康對(duì)照組T細(xì)胞百分比分別是(73.5±6.76)%、(72.91±7.88)%、(73.49±6.42)%。成人AL患者第2～5次化療后T細(xì)胞百分比升高，高于初診時(shí)，這結(jié)果與多個(gè)研究一致[1-3]，說(shuō)明T細(xì)胞的抑制狀態(tài)得到部分解除。

T細(xì)胞分化路徑為：多能祖細(xì)胞或共同淋巴樣祖細(xì)胞→雙陰性T細(xì)胞(double negative T cell,DNT細(xì)胞)→雙陽(yáng)性T細(xì)胞(double positive T cell,DPT)→能識(shí)別外來(lái)抗原的T細(xì)胞(CD4+T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞)。CD8+T細(xì)胞并非均一的細(xì)胞群體，有很多亞群如CTL、CD8+Treg細(xì)胞。在癌癥發(fā)生初期或者緩解期，機(jī)體的CTL可以殺傷少量腫瘤細(xì)胞，若癌細(xì)胞繼續(xù)增殖至一定數(shù)量或癌癥晚期，大多數(shù)患者已處于免疫抑制狀態(tài)或者免疫紊亂狀態(tài)，CTL的功能缺陷，則機(jī)體無(wú)法有效清除腫瘤細(xì)胞。本研究數(shù)據(jù)表明成人初診、未緩解AL患者CD8+T細(xì)胞百分比均高于健康人群，與孔令君等[1]研究一致，說(shuō)明初診時(shí)、未緩解時(shí)CD8+T細(xì)胞處于激活狀態(tài)，有利于抗白血病，但檢測(cè)到CD8+T細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量不增加，可能是因?yàn)槠渌?xì)胞數(shù)減少如NK細(xì)胞致CD8+T細(xì)胞百分比增加。張司琪、孫鴻麗等研究發(fā)現(xiàn)初診時(shí)、未緩解時(shí)CD8+T細(xì)胞與健康人群無(wú)差別，這與對(duì)照組的年齡、地區(qū)及所使用的流式儀型號(hào)有關(guān)[2-3,8-9]。

一般情況下，T細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程是受緊密調(diào)節(jié)的，所以認(rèn)為外周血DPT細(xì)胞是由于過(guò)早地從胸腺釋放出來(lái)的。DPT細(xì)胞在不同疾病的外周組織中所起作用不一樣，有時(shí)免疫抑制，如轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌DPT水平與TNF-α有關(guān)，可促進(jìn)結(jié)直腸癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移；有時(shí)表現(xiàn)為強(qiáng)效的細(xì)胞毒性作用，下調(diào)免疫系統(tǒng)對(duì)結(jié)直腸癌的殺傷[10-13]。DPT細(xì)胞在白血病的表達(dá)情況少有報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)表明成人AL患者在初診、化療后、未緩解時(shí)DPT細(xì)胞百分比是升高的，其在白血病患者中所起作用是抑制還是細(xì)胞毒性作用，還需進(jìn)一步研究，比如檢測(cè)分泌的細(xì)胞因子。

DNT細(xì)胞是一群既不表達(dá)CD4分子，也不表達(dá)CD8分子的T細(xì)胞。在人體中， DNT細(xì)胞作為免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞或細(xì)胞毒性T細(xì)胞參與免疫調(diào)節(jié)及免疫耐受。已有較多研究表明DNT細(xì)胞參與了免疫性疾病的發(fā)生及進(jìn)展[14-16]。Merims等[17]研究表明DNT細(xì)胞具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性，能夠殺傷自體的白血病細(xì)胞。丁榮[18]研究發(fā)現(xiàn)ALL兒童外周血DNT細(xì)胞水平低于健康人群。本文研究發(fā)現(xiàn)成人AL患者在初診時(shí)、化療后、未緩解時(shí)的DNT細(xì)胞百分比及數(shù)量與對(duì)照組比較無(wú)差別，這結(jié)果與丁榮不同，與兩個(gè)研究的對(duì)象年齡段及AL類型不同有關(guān)。關(guān)于AL患者的DNT細(xì)胞變化研究甚少，無(wú)法明確DNT細(xì)胞在AL的作用，尚需進(jìn)行分類型及功能的檢測(cè)。

綜上所述，NK細(xì)胞數(shù)量、T細(xì)胞百分比、CD8+T細(xì)胞百分比與化療次數(shù)有關(guān)。但本次研究樣本量較小、研究時(shí)間偏短，數(shù)據(jù)分析過(guò)程中相關(guān)偏倚不可避免，因此更大規(guī)模研究化療對(duì)AL患者免疫狀態(tài)影響，更有利于臨床醫(yī)生根據(jù)患者的免疫狀態(tài)個(gè)體化地選擇化療次數(shù)及方案。