李加林，馮 睿，張嘉文，吳素珍

(贛南醫(yī)學(xué)院 1.中藥學(xué)教研室；2.2014級本科中藥學(xué)專業(yè)；3.2019級碩士研究生；4.生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，江西 贛州 341000)

慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myelocytic leukemia，CML)是一種因?yàn)樵煅杉?xì)胞異常而影響血液、骨髓等的惡性腫瘤疾病，約占全部癌癥的0.3%，約占白血病里的20%[1]。它具有惡性侵襲、凋亡受抑和增生不休的的特征，如果不接受治療，最后會導(dǎo)致患者死亡[2-3]。惡性腫瘤的產(chǎn)生是一個由許多因素引起的并且非常復(fù)雜的過程，其中細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡的不平衡是其發(fā)生的最主要的原因[4]。細(xì)胞凋亡可以使機(jī)體內(nèi)過量的、被破壞的、不正常的細(xì)胞被及時清理。細(xì)胞凋亡不僅在細(xì)胞各個周期中起著重要作用，并且在腫瘤的產(chǎn)生、發(fā)展、治療等其他方面具有非常重要的意義。在腫瘤生成的過程中，細(xì)胞凋亡的主要能力是負(fù)調(diào)控，它能夠阻止腫瘤細(xì)胞飛速增長。涉及細(xì)胞凋亡的基因能劃分為兩種，第一種為促凋亡基因，第二種為抗凋亡基因。腫瘤的形成的原因之一就是細(xì)胞阻止凋亡的基因被激活或者促凋亡的基因被抑制，導(dǎo)致細(xì)胞無法死亡而一直生存下去。在抑制凋亡的基因中，最重要的是B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)[5]。許多由于細(xì)胞毒素引發(fā)的細(xì)胞死亡可由Bcl-2抑制，它的過度表達(dá)可以增強(qiáng)細(xì)胞對許多DNA損害因素的抵抗性，從而抑制細(xì)胞凋亡[6]。許多研究表明Bcl-2是細(xì)胞凋亡的多種信號路徑的相交點(diǎn)。

Caspase又稱為凋亡蛋白酶，存在于細(xì)胞質(zhì)中。因它被激活或者超量表達(dá)都會使細(xì)胞不可逆的邁向死亡，是在細(xì)胞凋亡里起到關(guān)鍵性作用的蛋白酶家族，而被稱做細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者和起始者。研究表明，細(xì)胞凋亡是因?yàn)閏aspase逐漸發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)造成的。細(xì)胞凋亡中最重要的終末剪切酶是caspase-3，它處于caspase級聯(lián)反應(yīng)的后部，可剪切caspase-2、6、7、9的前體，這種剪切是細(xì)胞程序性死亡關(guān)鍵的一部分[7]。

如今，對于白血病大多依舊采用聯(lián)合化療的手段進(jìn)行治療，雖然它的效果會比采用單一藥物治療好的多，但是依舊會產(chǎn)生很大的不良反應(yīng)，會對人體的免疫系統(tǒng)以及造血系統(tǒng)產(chǎn)生損傷。一些化療藥物雖然對白血病細(xì)胞有抑制作用，但是也會使正常細(xì)胞受到損傷[8]。隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)從中藥中尋找既有效，不良反應(yīng)又小的抗腫瘤藥物具有重要意義[9]。龍須藤來源于豆科羊蹄甲屬植物龍須藤[Bauhiniachampionii(Benth.) Benth.]的干燥藤莖[10]。龍須藤分布較廣，資源豐富，有止痛活血，健脾理氣，祛風(fēng)濕的作用[11-12]。該植物中主要含有黃酮類、多糖、甾醇類、揮發(fā)油、芳香酸類、萜類等化合物[13]，研究表明，龍須藤多甲氧基黃酮存在38個與癌癥有關(guān)的潛在靶點(diǎn)，而且多數(shù)集中于白血病、胰腺癌等方面[14]。還有研究發(fā)現(xiàn)，高劑量的多甲氧基黃酮對SW1353細(xì)胞的活性存在明顯的抑制作用[15]。有研究表明，5,7,3',4',5'-五甲氧基黃酮(5,7,3',4',5'-pentamethoxyflavone，PMF)可以很好的降低小鼠腺癌的發(fā)生概率，而且在黃酮分子骨架中含有的甲氧基部分可以提高預(yù)防癌癥的作用[16]。

本實(shí)驗(yàn)使用人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系K562細(xì)胞，研究從龍須藤中提取出來的一種多甲氧基黃酮PMF對其增殖和凋亡的影響，探討PMF能否促進(jìn)K562細(xì)胞的凋亡。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料人白血病細(xì)胞細(xì)胞株K562(由廣州萊德爾生物科技有限公司提供)，5,7,3',4',5'-五甲氧基黃酮(由贛南醫(yī)學(xué)院天然藥物研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，經(jīng)HPLC檢測其含量>95%)，胎牛血清(Gibco)，RPMI-1640培養(yǎng)基(Hyclone)，青鏈霉素(Hyclone)。蘇州安泰潔凈工作臺(SW-CJ-IFD)，倒置光學(xué)顯微鏡 (Nikon)，Multiskan FC酶標(biāo)儀(Thermo公司)，細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱(Thermo公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)將細(xì)胞放置在溫度恒定為37 ℃、二氧化碳濃度為5%、濕度為95%的培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)。每天使用倒置顯微鏡觀察其生長的狀況，取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞開展實(shí)驗(yàn)。

1.2.3吖啶橙(AO)染色法檢測細(xì)胞凋亡取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，用不同劑量的PMF處理24 h，1 000 rpm離心，時間為10 min，然后收集細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液PBS洗滌，再離心。將吖啶橙稀釋至終濃度為0.01%后，加入用PBS稀釋到一定濃度的細(xì)胞懸液中，避光反應(yīng)10 min，在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4蛋白免疫印跡(WesternBlot)法檢測細(xì)胞中Bcl-2、caspase-3蛋白表達(dá)當(dāng)K562細(xì)胞處于對數(shù)生長期時，將其移入4個小培養(yǎng)皿饑餓1晚，隔天將其分為正常組(不給藥)、低劑量組(35 μg·mL-1PMF)、中劑量組(70 μg·mL-1PMF)、高劑量組(140 μg·mL-1PMF)，分別給不同劑量的PMF，24 h后收細(xì)胞。將培養(yǎng)皿中細(xì)胞吹打混勻，分別放入對應(yīng)的離心管中，采用低溫離心機(jī)，調(diào)整溫度為4 ℃，12 000 g離心10 min，吸去上清液，用PBS磷酸鹽緩沖液洗滌后再次同條件離心，重復(fù)以上步驟3次。配制裂解液需要取1 mL RIPA裂解液，加入10 μL PMSF和20 μL蛋白酶抑制劑cocktail，混勻。在已經(jīng)棄去上清液的離心管中加入新配的裂解液120 μL，放在冰上裂解10 min。用5%的牛血清白蛋白按比例溶解一抗(β-actin 1∶1 000，Bcl-2 1∶3 000，caspase-3 1∶2 000)，在4 ℃條件下，用一抗將已封閉的NC膜搖床孵育過夜，第2天將一抗回收，用1×TBST洗3次NC膜，每次需要10 min，以洗去多余的抗體。接著用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔(β-actin 1∶10 000，Bcl-2 1∶20 000，caspase-3 1∶10 000)，最后用凝膠成像系統(tǒng)來檢測蛋白免疫印跡信號，蛋白的表達(dá)量用灰度值來表示。

2 結(jié) 果

2.1MTT法檢測PMF對K562細(xì)胞增殖的影響從表1可知，PMF處理后的細(xì)胞OD值明顯比正常組小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明低、中、高劑量的PMF對K562細(xì)胞均有抑制作用。隨著PMF劑量的增加，K562細(xì)胞的OD值明顯降低，表明這種抑制作用具有濃度依賴性，高劑量的PMF抑制其增殖效果較好。從圖1可以直觀的看出，PMF對K562細(xì)胞的抑制率隨著劑量的增長而升高。

表1 PMF對K562細(xì)胞增殖抑制的影響

注：與正常組比較，*P<0.05。

圖1 PMF對K562細(xì)胞的抑制率

注：正常組的PMF的含量為0 μg·mL-1；低劑量組的PMF含量為35 μg·mL-1；中劑量組的PMF的含量為70 μg·mL-1；高劑量組的PMF含量為140 μg·mL-1。與正常組比較，*P<0.05。

2.2吖啶橙(AO)染色觀察PMF對K562凋亡的影響吖啶橙染色顯示，正常的細(xì)胞核呈均勻的彌散的熒光，熒光較暗。經(jīng)過PMF處理后的細(xì)胞，出現(xiàn)非常典型的凋亡狀態(tài)，其細(xì)胞核縮小，呈聚縮狀態(tài)或破裂，染色加深，呈現(xiàn)顆粒狀或團(tuán)塊狀的強(qiáng)熒光。并且隨著PMF劑量的提高，凋亡的細(xì)胞數(shù)目變多(圖2)。

2.3PMF對K562細(xì)胞Bcl-2、caspase-3蛋白表達(dá)的影響分別用低、中、高劑量的PMF處理以后的K562細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)量均比正常組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨著PMF劑量的漸漸提高，Bcl-2的蛋白表達(dá)量不斷下調(diào)。與正常組相比，分別用低、中、高劑量的PMF處理以后的K562細(xì)胞caspase-3蛋白表達(dá)量均比正常組高(P<0.05)。并且隨著PMF劑量的不斷提高，caspase-3的表達(dá)漸漸升高。蛋白的相對表達(dá)量=目的蛋白的表達(dá)水平/(β-actin的蛋白表達(dá)水平)。Bcl-2蛋白相對表達(dá)量柱狀圖提示抗凋亡的蛋白表達(dá)逐漸下降，caspase-3蛋白相對表達(dá)量柱狀圖也表明了促凋亡的蛋白表達(dá)上調(diào)(圖3)。以上結(jié)果說明，PMF可以抑制K562細(xì)胞Bcl-2表達(dá)，對K562細(xì)胞caspase-3表達(dá)具有促進(jìn)作用。

圖2 PMF對K562細(xì)胞影響的形態(tài)學(xué)觀察

圖3 PMF對K562細(xì)胞Bcl-2和caspase-3表達(dá)的影響

3 討 論

白血病大多仍然采用聯(lián)合化療的方式治療，雖然它的效果會比采用單一藥物治療好的多，但是依舊會產(chǎn)生很大的不良反應(yīng)，而且還有很大復(fù)發(fā)的可能性。隨著研究的不斷深入，引導(dǎo)細(xì)胞凋亡越來越成為治療白血病的熱門方法。在治療血癌的方面，中藥有著極為漫長的歷史。PMF有很強(qiáng)的藥理作用，是一種很好的抗癌物質(zhì)。許多研究者提取多甲氧基黃酮進(jìn)行研究，并且對該化合物的抗風(fēng)濕、鎮(zhèn)痛抗炎作用有所報道。雖然對腫瘤細(xì)胞的抑制作用和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡方面的研究并沒有很多，但是PMF的抗腫瘤作用已經(jīng)得到了證實(shí)[16]。通過MTT實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)PMF可以抑制K562細(xì)胞的增殖，且隨著劑量的增加抑制呈上升趨勢。經(jīng)由吖啶橙染色可以清晰地觀察到K562細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象。經(jīng)過Western Blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Bcl-2的表達(dá)下調(diào)，caspase-3的表達(dá)上調(diào)，這些說明PMF具有抑制K562細(xì)胞增殖的活性，誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡。但是余方榮使用MTT法測各種濃度梅花入骨丹總黃酮處理的人軟骨細(xì)胞活性，發(fā)現(xiàn)低劑量的梅花入骨丹總黃酮會提高SW1353細(xì)胞的活性，而高劑量的梅花入骨丹總黃酮會明顯抑制SW1353細(xì)胞的生長活性[17]。這與本實(shí)驗(yàn)所得出的K562的細(xì)胞增殖會受到低劑量的PMF的抑制的結(jié)果不一致。該情況可能是因?yàn)辄S酮類化合物的活性中心是α，β不飽和吡喃酮，A、B、C三環(huán)上的取代基會決定該黃酮類化合物特殊的藥理作用。余方榮的研究使用的是總黃酮，而PMF是一種已經(jīng)經(jīng)過提取分離的中藥活性單體，這兩種物質(zhì)是不相同的?？傸S酮里的其他有效成分即使為低劑量可能會有更強(qiáng)的增加腫瘤細(xì)胞活性的作用，從而掩蓋了抑制其活性的那些成分。但是一旦提高了劑量，抑制腫瘤細(xì)胞活性的成分將會發(fā)揮更大的作用。PMF對K562細(xì)胞增殖的抑制作用即通過抑制Bcl-2表達(dá)，提高caspase-3的蛋白表達(dá)，促進(jìn)K562細(xì)胞凋亡。本研究將為PMF作為抗白血病藥物的開發(fā)研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，其作用機(jī)理還有待深入研究。