薛 夢，孫亞蘭，黃 誠

(贛南醫(yī)學院 1.2017級碩士研究生；2.2018級碩士研究生；3.基礎醫(yī)學院；4.疼痛醫(yī)學研究所，江西 贛州 341000)

疼痛是一種嚴重影響患者生活質量的病理生理性疾患，主要有急性痛和慢性痛[1]。神經病理性疼痛(Neuropathic pain, NP)是慢性疼痛的一種，它是由中樞以及外周神經系統的損傷和功能障礙所引起的一種復雜性疾病[2]。緣由神經病理性疼痛的病理生理學機制較為復雜且目前的治療效果不佳，因此，對其發(fā)病機制以及臨床治療的研究就顯得尤為迫切和重要。

針灸是祖國的傳統醫(yī)學，由針灸發(fā)展而來的電針(Electroacupuncture, EA)，因其不良反應較小，在臨床上有較廣泛的應用，比如，電針對慢性疼痛的治療作用已經得到了全球的認可[3-4]，但其作用機制還有待于進一步闡明。特別值得一提的是，2019年世界衛(wèi)生組織(WHO)與世界針灸學會聯合會(WFAS)建立了正式工作關系[5-7]，這預示著電針在醫(yī)學領域的應用研究將愈來愈受到關注。我們課題組前期研究發(fā)現，干擾素調節(jié)因子8(transcription factors interferon regulatory factor 8, IRF8)在背根神經節(jié)(Dorsal root ganglion, DRG)上參與了2Hz電針對選擇性神經損傷模型(Spared nerve injury, SNI)大鼠的鎮(zhèn)痛作用[8]。另有實驗表明，IRF8通過影響脊髓小膠質細胞的轉錄基因，激活小膠質細胞[9]，形成中樞敏化，進而導致慢性疼痛的發(fā)生發(fā)展，但是關于IRF8是如何通過小膠質細胞來影響中樞敏化的具體機制還不甚清楚[10-11]。在神經病理性疼痛的狀態(tài)下，激活的小膠質細胞可釋放腦源性神經營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)，BDNF/TrkB信號通路是形成中樞敏化的重要通路之一，并且已被大量實驗證明其可通過N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor, NMDAR)參與中樞敏化[12-13]。另有研究發(fā)現哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)在神經元可塑性中發(fā)揮重要作用[14]，mTOR可通過調控NMDAR參與神經病理性疼痛的中樞敏化[15]?；诖?，我們提出假設：電針對IRF8與mTOR參與中樞敏化的調控作用是否與BDNF信號通路有一定的聯系。為此，本實驗擬在SNI誘導的神經病理性疼痛大鼠模型上，探討鞘內給予外源性BDNF后，其對2Hz電針作用于神經病理性疼痛大鼠脊髓IRF8和mTOR的表達影響，以期為電針進一步應用于臨床治療神經病理性疼痛提供理論依據。

1 資料和方法

1.1實驗動物與分組SPF級雄性SD大鼠24只，體重180～220 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供[動物中心許可證號：SCXK(湘)2016-0002]，所有實驗動物嚴格遵守贛南醫(yī)學院動物倫理委員會的要求。實驗動物隨機分為6組(n=4)：Sham組，SNI組，SNI+Mock EA組，SNI+EA組，SNI+EA+BDNF組和SNI+EA+PBS組。在SNI術后1天，分別對SNI+EA組，SNI+EA+BDNF組和SNI+EA+PBS組大鼠雙側的足三里和三陰交穴位進行隔日電針治療14天，SNI+Mock EA組僅扎針不給予電刺激。Sham組暴露坐骨神經不進行結扎剪斷。所有大鼠在電針后的第14天取材。

1.2實驗試劑與儀器華佗牌一次性針灸針(0.28 mm×15 mm，蘇州醫(yī)療用品有限公司)，韓氏多功能電針儀(北京華運安特科技有限公司)。反轉錄試劑盒購自 invitrogen 公司(貨號: C28025)，SYBR?Select Master Mix: Life technologies(貨號:4368813)，IRF8和 mTOR 的特異性引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3鞘內置管及給藥方法麻醉后的大鼠俯臥位固定于動物手術臺，沿背部正中切開皮膚，在L4/L5椎間隙處進行穿刺，見大鼠尾巴甩動進行置管，PE-10導管置入約3.5 cm，將PE-10導管外端自皮下由頭頸部穿出，多點進行固定。術畢動物放回鋪有墊料的大鼠飼養(yǎng)籠，單籠飼養(yǎng)。觀察4～5天后，剔除置管不成功(癱瘓或跛行)，然后進行神經病理性疼痛大鼠模型手術。在電針治療SNI大鼠后的第12天，連續(xù)鞘內給予外源性的BDNF兩天，一天兩次，每次100 ng，每次間隔30 min。

1.4神經病理性疼痛大鼠模型制備參照文獻[16]介紹的方法建立SNI模型，大鼠用2%～3%濃度的異氟烷進行麻醉。分離左側脛神經和腓總神經，保留腓腸神經，用4號線分別結扎并剪斷脛神經和腓總神經，建立SNI大鼠模型，Sham組僅暴露脛神經和腓總神經，不進行結扎剪斷，其他手術操作同前，麻醉蘇醒后將大鼠放回原籠。

1.5qPCR檢測電針后第14天，取L4～L6段脊髓組織置于1.5 mL的無酶的EP管，加入10倍體積的Trizol，用勻漿器充分將脊髓組織裂解，再加入1/5的氯仿，上下顛倒混勻15～30 s，室溫靜置5 min，4°，12 000×g，離心15 min。然后取上層水相，加入等體積異丙醇，混勻，室溫靜置10 min，4°，12 000×g，離心10 min。加入75%的乙醇(用去RNA酶水配制)用于洗滌沉淀，洗滌后 4°，7 500×g，離心10 min，棄乙醇，進行干燥。加20 μL的RNase Free 的水溶解，定量。逆轉錄成cDNA后，行實時定量PCR實驗。qPCR反應體系: cDNA 2 μL，1×SYBR 10 μL，加超純水至20 μL。反應條件：95℃預變性20 min，PCR反應，95 ℃變性10 s，61 ℃退火20 s，72 ℃延伸25 s，共40個循環(huán)。各引物序列由上海生工生物公司合成，其引物序列如下(表1)。

表1 PCR引物序列

2 結 果

2.12Hz電針對SNI模型大鼠脊髓IRF8和mTOR的mRNA表達的影響為觀察SNI模型大鼠脊髓IRF8和mTOR在2Hz電針的作用，我們在第14天取材后，應用qRT-PCR檢測大鼠脊髓IRF8和mTOR的mRNA表達水平。結果顯示，與Sham組相比，SNI大鼠脊髓IRF8 的mRNA表達明顯增高(P<0.05)；與SNI組相比，SNI+EA組大鼠脊髓IRF8的 mRNA表達明顯下降(P<0.05)；與SNI組相比，SNI+Mock EA組大鼠脊髓IRF8的mRNA表達變化不明顯，差異無統計學意義(見圖1A)。同樣，SNI大鼠脊髓mTOR的 mRNA表達顯著高于Sham組(P<0.01)；SNI+EA組大鼠脊髓mTOR 的mRNA表達明顯低于SNI組(P<0.05)；與SNI+EA組相比，SNI+Mock EA組大鼠脊髓中的mTOR mRNA表達變化不明顯，差異無統計學意義(見圖1B)。

圖1 2Hz EA對SNI模型大鼠脊髓IRF8和mTOR的 mRNA的影響

2.2鞘內注射外源性BDNF對2Hz電針作用于大鼠脊髓IRF8和mTOR的mRNA表達影響為進一步探討B(tài)DNF對2Hz電針作用于大鼠脊髓IRF8和mTOR 的表達影響，我們在SNI大鼠經電針治療后的第12、13天分別鞘內注射PBS和BDNF，每天2次，每次間隔半小時，注射劑量100 ng。我們的實驗結果顯示，與PBS組相比，BDNF組大鼠脊髓中IRF8 mRNA的表達顯著升高(P<0.05)(見圖2A)。同樣的，BDNF組大鼠脊髓中mTOR mRNA的表達也明顯高于PBS組(P<0.05)(見圖2B)。

圖2. 鞘內注射BDNF對脊髓IRF8和mTOR的mRNA的影響

3 討 論

神經病理性疼痛因其中樞和外周神經系統的損傷病變而產生的機制比較復雜，導致其治療難度大，至今仍未有較好的治療方式。針灸在中國有著悠久且輝煌的臨床應用歷史，由針灸發(fā)展而來的電針，因其可以通過刺激頻率、強度和持續(xù)時間等參數進行標準化而更有利于開展科學研究[5]。由于電針具有良好的鎮(zhèn)痛效果，在臨床上也得到了廣泛運用，但目前有關電針治療神經病理性疼痛的機制仍然不是很清楚。我們在脊髓水平的實驗結果發(fā)現，2Hz電針能夠顯著降低神經病理性疼痛大鼠脊髓IRF8和mTOR的基因表達，而BDNF可翻轉2Hz電針的這種作用，這提示BDNF參與了2Hz電針對SNI大鼠脊髓IRF8和mTOR的調控作用。

有研究報道IRF8也稱為干擾素同源序列結合蛋白，是干擾素(IFNs)在多種細胞類型中誘導的IRF轉錄因子家族的成員之一[17]。課題組前期結果顯示，IRF8在SNI大鼠模型的DRG有表達，并參與機械痛敏的形成[8]。有證據表明，IRF8在免疫細胞(如淋巴細胞和樹突狀細胞)以及外周神經損傷(peripheral nerves injuries, PNI)后的免疫系統和脊髓均有表達[9]，而且IRF8在脊髓水平可通過激活小膠質細胞參與神經病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展[18]。在PNI模型中，IRF8激活脊髓小膠質細胞后以p38依賴性方式釋放炎性細胞因子，進而形成中樞敏化[11]。進一步的實驗發(fā)現，脊髓IRF8參與神經病理性疼痛與小膠質細胞P2X4受體的驅動有著密切的關系[19-20]。這些研究都證實了IRF8可調控小膠質細胞的激活和轉錄[9,21]，而活化的小膠質細胞參與誘導中樞敏化并維持與小膠質細胞相關的持續(xù)性疼痛[22-23]。BDNF已被證明在脊髓水平可誘發(fā)中樞敏化，是引發(fā)神經病理性疼痛的重要信號通路之一[12-13]。而且脊髓小膠質細胞激活后可釋放BDNF，進一步加強傷害性敏化[24]。Fang等[25]發(fā)現，在SNI模型中，脊髓IRF8可以通過下調BDNF來緩解神經病理性疼痛。表觀遺傳學實驗進一步證實，小膠質細胞中的IRF8和P2X4受體上調[26]，而且BDNF在小膠質細胞的表達也上調，認為這是導致中樞敏化和痛敏行為的一個關鍵因素。以上結果提示，IRF8在脊髓水平通過小膠質細胞誘發(fā)中樞敏化，進而導致神經病理性疼痛，但引起中樞敏化的原因很可能與BDNF有關。

mTOR是細胞生長和增殖的重要調節(jié)因子。有研究發(fā)現，在糖尿病誘導的神經病理性疼痛模型中，mTOR在DRG的表達明顯上調，阻斷mTOR后可顯著提高模型大鼠的機械退縮閾值，進而緩解疼痛[27]。在坐骨神經慢性壓迫(Chronic constriction injury,CCI)模型中，脊髓的mTOR蛋白表達明顯升高，并誘發(fā)神經病理性疼痛[28]。最近的證據表明，mTOR在脊髓參與突觸可塑性的變化，是調節(jié)傷害性敏化發(fā)展必不可少的因素[14,29]。在脊髓背角中，mTOR通路的激活參與了NMDAR觸發(fā)的中樞敏化[15]。在糖尿病所誘導的神經病理性疼痛狀態(tài)下，脊髓mTOR的激活介導了突觸蛋白Ⅱ和神經突增生的上調[30]，兩者均可導致痛覺過敏，這進一步說明mTOR在神經元可塑性中所發(fā)揮的作用，而且這可能與谷氨酸的過量釋放以及GABA能神經元突觸傳遞有關。有實驗表明，脊髓的BDNF-mTOR信號通路參與痛覺過敏[31]。在前扣帶回皮層，BDNF激活mTOR后上調NR2B可誘導炎性痛和厭惡情緒的產生[32]。以上研究證實，BDNF可通過激活mTOR參與脊髓可塑性并誘導中樞敏化，進而產生神經病理性疼痛。

神經病理性疼痛是一個世界性難題，因其復雜的病理機制及治療難度一直困擾著眾多患者。脊髓中樞敏化是神經病理性疼痛發(fā)病機制中的一個重要環(huán)節(jié)，BDNF信號所誘導GluN2B-NMDA受體觸發(fā)的中樞敏化已得到了認可[12,33]，有關其上下游分子的作用仍有待于進一步研究。有文獻報道，BDNF信號的上游分子IRF8和下游分子mTOR與中樞敏化有著重要的聯系，并且電針通過下調mTOR進而抑制由脊髓損傷所引起的神經病理性疼痛[34]。重要的是我們課題組前期的研究表明，電針可通過下調DRG的IRF8表達來緩解神經病理性疼痛[8]。本實驗探討了脊髓的IRF8和mTOR在2Hz電針對SNI誘導神經病理性疼痛的作用，我們發(fā)現SNI可明顯提高大鼠脊髓IRF8和mTOR的mRNA表達，而2Hz電針可顯著下調大鼠脊髓IRF8和mTOR的mRNA水平。為進一步探索BDNF與中樞敏化的關系，在2Hz電針治療SNI誘導的神經病理性疼痛大鼠后，外源性給予BDNF，發(fā)現BDNF可明顯翻轉2Hz電針對SNI大鼠IRF8和mTOR的mRNA表達。我們的實驗提示，在SNI誘發(fā)的神經病理性疼痛大鼠模型中，2Hz電針有可能通過下調SNI大鼠脊髓IRF8和mTOR的表達來抑制BDNF所誘導的中樞敏化。

綜上所述，2Hz電針鎮(zhèn)痛的脊髓機制有可能是通過下調IRF8和mTOR來抑制中樞敏化，并且BDNF參與這一過程，這將為電針治療神經病理性疼痛提供一個新思路，即2Hz電針通過阻斷IRF8和mTOR的表達發(fā)揮對神經病理性疼痛的緩解作用。但本實驗并未進一步應用IRF8、BDNF和mTOR的抑制劑去反向探討電針的作用機制，這有待于今后的研究加以闡明。