王釗，張雪，黃淑媛，陳紫蘊(yùn)，鄒建

(河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，鄭州 450046)

紅色鮮艷、亮麗，是一種深受人們喜愛(ài)的色彩用在食品中能夠增強(qiáng)食欲和刺激購(gòu)買欲[1]。當(dāng)前食品添加劑中存在大量的食用紅色素，主要可分為人工合成紅色素和天然紅色素兩大類。其中，合成色素具有色澤鮮艷、著色力強(qiáng)、不易褪色、堅(jiān)牢度大、性質(zhì)穩(wěn)定、易溶解、成本較低等優(yōu)點(diǎn)[2]；但同時(shí)也存在營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較低，增加肝腎負(fù)擔(dān)[3]，具有潛在的致癌、致畸、致突變作用等安全問(wèn)題[4]。因此，天然可食用紅色素的開(kāi)發(fā)成為重要研究方向。

天然可食用紅色素種類繁多，除著色外，還具有抗菌消炎、降低血脂等多重生理功能[5,6]。其中，辣椒紅素因其美觀的色澤、良好的上色能力、較高的安全性和潛在的營(yíng)養(yǎng)保健功能受到人們的喜愛(ài)[7-9]；此外，辣椒紅素還具有穩(wěn)定性強(qiáng)，不易受光、熱、酸、堿等條件影響的優(yōu)點(diǎn)[10]。然而在提取辣椒紅色素時(shí)需除辣，既增加了成本,又會(huì)產(chǎn)生新的雜質(zhì)[11]。與之相比，紅甜椒色澤艷麗，畝產(chǎn)量是辣椒的5倍[12]，其紅色素的溶解性、穩(wěn)定性、安全性與辣椒紅色素相似，且無(wú)需除辣，工藝簡(jiǎn)單，極具研究和應(yīng)用價(jià)值。研究表明，甜椒紅色素色澤鮮艷，耐光、耐熱、耐酸堿、耐氧化，色澤光亮，色度穩(wěn)定，視感良好，并具有抗氧化，預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化，抑制腫瘤等多種保健功能，可用于食品、日化、醫(yī)藥等多個(gè)領(lǐng)域[13]。

鑒于甜椒紅色素的優(yōu)秀品質(zhì)以及國(guó)內(nèi)相關(guān)研究較少的現(xiàn)狀[14]，本文擬通過(guò)有機(jī)溶劑提取法對(duì)甜椒紅色素進(jìn)行提取，并優(yōu)化其工藝條件。在參考辣椒紅素的相關(guān)提取工藝方案后[15,16]，引入超聲波輔助提取手段，并通過(guò)正交試驗(yàn)法對(duì)各單因素提取條件進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑

新鮮紅甜椒：購(gòu)于鄭州市丹尼斯超市；無(wú)水乙醇(分析純)、乙酸乙酯(分析純)：天津富宇精細(xì)化工有限公司；丙酮(分析純)、氯仿(分析純)：北京國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水甲醇(分析純)、甲苯(分析純)、石油醚(分析純)：煙臺(tái)雙雙化工有限公司；氫氧化鈉(分析純)：河北萬(wàn)曄科技發(fā)展有限公司；檸檬酸(分析純)：濰坊英軒實(shí)業(yè)有限公司；抗壞血酸(分析純)：鄭州嵩樺商貿(mào)有限公司。

1.2 試驗(yàn)儀器

HY/HYS-3L/5L型油浴鍋 鄭州博科儀器設(shè)備有限公司；RE-32型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；KQ5200E型超聲波清洗器 昆明市超聲儀器有限公司；FA3204B型電子分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；TU-1901型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；FreeZone型真空冷凍干燥儀 美國(guó)LABCONCO儀器公司。

1.3 試驗(yàn)步驟

1.3.1 紅甜椒的預(yù)處理

由于甜椒含有多種營(yíng)養(yǎng)成分和豐富的紅色素，若直接暴露在空氣中進(jìn)行切片、粉碎等操作易發(fā)生氧化作用而影響甜椒品質(zhì)。烘干等高溫干燥處理方法，雖然具有良好的干燥效果，但在加熱過(guò)程中可能對(duì)色素產(chǎn)生不利影響，因此本文采用真空冷凍干燥法[17,18]，根據(jù)真空凍干曲線對(duì)紅甜椒進(jìn)行冷凍干燥處理。最后將干燥好的甜椒粉碎，密封，置于干燥器中備用。

1.3.2 提取溶劑的選擇

分別稱取處理好的甜椒粉1.0 g，首先按照文獻(xiàn)報(bào)道的最佳提取條件(料液比1∶16，溫度50 ℃，時(shí)間3 h，溶劑乙醇)對(duì)溶劑進(jìn)行篩選。分別量取等量的無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、丙酮、氯仿、無(wú)水甲醇、甲苯、石油醚7種有機(jī)溶劑按照文獻(xiàn)條件進(jìn)行提取，通過(guò)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行全波段掃描，觀察紫外吸收曲線。已知甜椒紅色素的乙醇溶液的最大吸收波長(zhǎng)在450～480 nm，并確定其他溶劑最大吸收波長(zhǎng)的位置。

1.3.3 單因素試驗(yàn)條件設(shè)計(jì)

分別設(shè)置料液比(1∶12、1∶16、1∶20、1∶24、1∶28)、提取溫度(50，55，60，65，70，75 ℃)、超聲時(shí)間(10，20，30，40 min)、提取時(shí)間(3，3.5，4，4.5，5，5.5，6 h)4個(gè)單因素中的3個(gè)因素不變，探究另一個(gè)因素變化對(duì)提取甜椒紅色素的影響，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步對(duì)單因素條件進(jìn)行優(yōu)化，直至達(dá)到最優(yōu)水平。

1.3.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過(guò)對(duì)單因素試驗(yàn)結(jié)果的分析，在此基礎(chǔ)上，選擇提取溫度、料液比、超聲時(shí)間、提取時(shí)間4個(gè)因素中的較優(yōu)水平，選用L9(34)正交試驗(yàn)水平表，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化提取甜椒紅色素的工藝條件。

1.3.5 最佳工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

在正交試驗(yàn)得出的最佳提取條件下重復(fù)3次提取，對(duì)正交試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，分析驗(yàn)證試驗(yàn)的結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶劑對(duì)提取效果的影響

使用無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、丙酮等7種有機(jī)溶劑對(duì)甜椒紅色素進(jìn)行提取，通過(guò)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)其最大吸收波長(zhǎng)和相應(yīng)吸光度值。試驗(yàn)結(jié)果表明，不同溶劑顯示的甜椒紅色素最大吸收波長(zhǎng)均在450～480 nm范圍內(nèi)，與文獻(xiàn)報(bào)道吻合(見(jiàn)表1)；不同溶劑的提取效果差別較大，見(jiàn)圖1。

表1 不同有機(jī)試劑顯示的最大吸收波長(zhǎng)Table 1 The maximum absorption wavelength of different organic reagents

圖1 不同溶劑對(duì)提取效果的影響Fig.1 Effect of different solvents on the extraction effect

由圖1可知，以上7種溶劑中氯仿對(duì)甜椒紅色素的提取效果最好，然后由大到小依次是：甲醇>丙酮>乙酸乙酯>乙醇>石油醚>甲苯，其中甲醇、丙酮和乙酸乙酯彼此間的差異較小，而石油醚和甲苯的提取效果明顯較差，予以排除。由于氯仿、甲醇、丙酮均為有毒試劑，而乙酸乙酯沸點(diǎn)適中、毒性很小且提取效果明顯優(yōu)于乙醇，綜合考慮安全性、溶劑價(jià)格和可操作性，選擇乙酸乙酯作為提取試劑進(jìn)一步優(yōu)化試驗(yàn)條件。

2.2 單因素條件對(duì)提取效果的影響

2.2.1 料液比對(duì)提取效果的影響

(a)

(b)

稱取5份1.0 g的甜椒粉，分別按照料液比1∶12、1∶16、1∶20、1∶24、1∶28的比例準(zhǔn)確量取乙酸乙酯，在50 ℃油浴中恒溫提取3 h，過(guò)濾后定容至100 mL，在波長(zhǎng)475 nm處平行測(cè)量3次，其平均吸光度值見(jiàn)圖2中(a)。由圖2中(a)可知，當(dāng)料液比增大，提取效率隨之增大，料液比1∶24時(shí)為最大值；此后繼續(xù)增大料液比溶液的吸光度值有所下降(1∶28)。因此，以料液比1∶24為中心，對(duì)其兩側(cè)的料液比進(jìn)行篩選，進(jìn)行精確定位料液比的試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2中(b)。當(dāng)料液比從1∶21遞增至1∶26時(shí)，測(cè)得的吸光度值依然以1∶24時(shí)最大，因此選擇1∶24為最佳料液比條件。

2.2.2 超聲時(shí)間對(duì)提取甜椒紅色素的影響

稱取4份1.0 g的甜椒粉，按照料液比1∶24加入乙酸乙酯，經(jīng)超聲處理(10，20，30，40 min)后，在50 ℃油浴條件下恒溫提取3 h，過(guò)濾后定容至100 mL，在波長(zhǎng)475 nm處平行測(cè)量3次，結(jié)果見(jiàn)圖3中(a)。提取效率隨超聲時(shí)間增長(zhǎng)而提高，當(dāng)超聲時(shí)間為30 min時(shí)，溶液的吸光度值最大，繼續(xù)延長(zhǎng)超聲時(shí)間至40 min，吸光度值反而下降。然后以30 min時(shí)長(zhǎng)為中心，考察其兩側(cè)時(shí)長(zhǎng)條件下(25,35 min)的吸光度值，結(jié)果見(jiàn)圖3中(b)。30 min時(shí)長(zhǎng)條件下的吸光度值依然為最大值，表明30 min為最佳超聲時(shí)間條件。

(a)

(b)

2.2.3 溫度對(duì)提取甜椒紅色素的影響

稱取6份1.0 g的甜椒粉，分別按照1∶24的料液比和30 min的超聲時(shí)間，在不同的油浴溫度(50,55,60,65,70,75 ℃)下提取3 h，過(guò)濾后定容至100 mL，在波長(zhǎng)475 nm處平行測(cè)量3次，得到平均吸光度，結(jié)果見(jiàn)圖4中(a)。提取效率隨提取溫度的上升而上升，在50～75 ℃范圍內(nèi)，提取溫度越高，提取效果越好，75 ℃時(shí)吸光度值最大。然后以75 ℃為中心對(duì)其兩側(cè)的溫度篩選。又由于乙酸乙酯的沸點(diǎn)為77 ℃，因此選擇73～77 ℃為溫度范圍，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖中4(b)。雖然吸光度值有所波動(dòng)，但75 ℃時(shí)吸光度值依然最高，因此選擇75 ℃為最佳提取溫度。

(a)

(b)

2.2.4 提取時(shí)間對(duì)提取甜椒紅色素的影響

稱取6份1.0 g的甜椒粉，在已經(jīng)確定的物料比(1∶24)、超聲時(shí)間(30 min)、提取溫度(75 ℃)條件下分別提取數(shù)小時(shí)，過(guò)濾后定容至100 mL，在波長(zhǎng)475 nm處平行測(cè)量3次，平均吸光度值見(jiàn)圖5。隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)，吸光度值也隨之增大，在4 h時(shí)具有最大值。當(dāng)時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，吸光度值反而隨之降低，雖然在5 h時(shí)略有增加，但總體趨勢(shì)從4 h后下降，故選擇4 h為最佳提取時(shí)間。

圖5 不同提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響Fig.5 Effect of different extraction time on the extraction effect

2.3 正交試驗(yàn)與條件優(yōu)化

2.3.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過(guò)對(duì)各單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，固定提取溶劑為乙酸乙酯不變，對(duì)提取溫度(73，74，75 ℃)、料液比(1∶23、1∶24、1∶25)、提取時(shí)間(3.5，4，4.5 h)、超聲時(shí)間(25，30，35 min)進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)，篩選最優(yōu)提取方案，正交試驗(yàn)水平設(shè)計(jì)表見(jiàn)表2，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 L9(34)正交試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and levels of L9(34) orthogonal experiment

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of orthogonal experiment

續(xù) 表

由表3中的極差R值可知，提取甜椒紅色素的4個(gè)影響因素均對(duì)提取效果有影響，各影響因素對(duì)提取效果的影響力大小依次為：A(提取溫度)>B(料液比)>C(提取時(shí)間)>D(超聲時(shí)間)，其中最重要的影響因素是提取溫度。因此，根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，提取甜椒紅色素的最優(yōu)方案為A2B2C1D2，即提取溫度75 ℃、料液比1∶24、提取時(shí)間3.5 h，超聲時(shí)間30 min。

2.3.2 最優(yōu)工藝條件驗(yàn)證試驗(yàn)

表4 重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of repeated experiment

由于最佳提取方案并未在正交試驗(yàn)表中，為確保其真實(shí)性，在該提取工藝條件下進(jìn)行了3 組重復(fù)驗(yàn)證性試驗(yàn)，并取其平均值。由表4可知，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果具有代表性，表明該提取工藝條件是合理可行的，重現(xiàn)性好。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)甜椒粉中甜椒紅色素提取的單因素條件進(jìn)行篩選，結(jié)果表明在單因素試驗(yàn)中，以乙酸乙酯為提取劑，各項(xiàng)最佳條件分別為：溫度75 ℃，料液比1∶24，超聲時(shí)間30 min，提取時(shí)間4 h。而在正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，最佳提取工藝條件為：以乙酸乙酯為提取試劑，溫度75 ℃、料液比1∶24、提取時(shí)間3.5 h、超聲時(shí)間30 min。通過(guò)3次平行重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，所得吸光度值重現(xiàn)性較好，說(shuō)明此工藝條件對(duì)甜椒紅色素的提取具有明顯優(yōu)勢(shì)，為將來(lái)更深入地研究甜椒紅色素的工業(yè)化生產(chǎn)提供了一定的理論支持。