王嘉瑞，李青卓，胡文康，孫莉，汪超，徐寧

(湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院 湖北省食品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心,武漢 430068)

臘八豆作為一種典型的發(fā)酵豆類食品，是中國傳統(tǒng)美食之一。多在冬至后制作,至臘月初八起食用,故稱臘八豆。現(xiàn)代生產(chǎn)臘八豆的工藝以新鮮的黃豆為原料，輔以花椒、鹽為佐料，經(jīng)過蒸煮，接種純種毛霉，密封厭氧發(fā)酵。臘八豆富含氨基酸、維生素、功能性短肽、大豆異黃酮等生理活性物質(zhì)，具有很好的保健功效，又因為其味道鮮香辣，回味綿長，深受人們的喜愛。

隨著人們生活品質(zhì)的提高，不管是對食品的色、香、味，還是對其營養(yǎng)物質(zhì)含量均有一定的要求。對于傳統(tǒng)發(fā)酵食品，微生物菌種、底物調(diào)控和發(fā)酵工藝均是影響其風(fēng)味物質(zhì)的重要因素。風(fēng)味物質(zhì)是影響臘八豆品質(zhì)的一個重要指標(biāo)，大部分風(fēng)味物質(zhì)是微生物在發(fā)酵過程中，通過不同的代謝途徑利用原料中的脂肪、淀粉、蛋白質(zhì)經(jīng)微生物酶水解后產(chǎn)生的各類次級產(chǎn)物與小分子風(fēng)味成分[1]。

食品中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分往往種類多，含量低，且復(fù)雜不穩(wěn)定，提取過程中還容易受外界條件影響，所以其分析結(jié)果的準(zhǔn)確性很大程度上取決于香氣物質(zhì)的提取方式。選擇合適的研究分析方法來鑒別特征風(fēng)味物質(zhì)的組成，對產(chǎn)品的研制和生產(chǎn)具有重要意義，同時對于發(fā)酵豆醬類產(chǎn)品的后期香味調(diào)控也有一定的意義。

目前國內(nèi)外對中國豆豉風(fēng)味的研究很少,尤其是對曲霉豆豉風(fēng)味的研究還處于起步階段。歐陽晶等用SPME-GC-MS技術(shù)對低溫發(fā)酵臘八豆揮發(fā)性成分隨時間變化做過相關(guān)研究，因為方法限制，無法得到各揮發(fā)性成分的香氣活性值，因此無法確定各組分化合物對臘八豆風(fēng)味的影響[2]。對于不同的品牌和不同的提取方法檢測臘八豆風(fēng)味成分的報道還比較少見。

同時蒸餾萃取法(simultaneous distillation extraction,SDE)和固相微萃取法(headspace solid-phase microextraction,HS-SPME)是兩種常見的香氣提取方法[3]。SDE法測定范圍較寬，可用來提取揮發(fā)性、半揮發(fā)性風(fēng)味成分，但主要以高沸點化合物為主，且其部分成分可能是由于高溫導(dǎo)致了某些化學(xué)反應(yīng)轉(zhuǎn)變而來的揮發(fā)性物質(zhì)；HS-SPME法比較靈敏，無溶劑且方便易行，可縮短分析時間，但萃取頭只能選擇性吸附一部分揮發(fā)性成分。

本文采用兩種不同的揮發(fā)性物質(zhì)提取方法SDE法和HS-SPME法經(jīng)GC-MS檢測分析了臘八豆揮發(fā)性風(fēng)味成分，比較兩種方法提取4種臘八豆揮發(fā)性成分的差異和特征，為臘八豆產(chǎn)品的風(fēng)味物質(zhì)定性提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

臘八豆樣品：湖南長沙錦程香辣臘八豆(JC)、湖南益陽辣妹子原味臘八豆(LMZ)、湖南長沙田野故事香辣臘八豆(TYGS)、湖北宜昌土道家臘八豆(TDJ)；氯化鈉、二氯甲烷、無水硫酸鈉：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

SPME手動進(jìn)樣手柄及萃取頭(CAR/PDMS) 美國Supelco公司；Agilent GC-MS 7890B-5977B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國安捷倫公司；HH-8CJ數(shù)顯磁力攪拌恒溫水浴鍋 常州市金壇友聯(lián)儀器研究所。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備

用紗布將臘八豆的油過濾除去，用研缽將臘八豆研碎，作為待測試樣。

1.2.2 SDE法條件

稱取臘八豆研碎樣100 g置于同時蒸餾萃取裝置的500 mL圓底燒瓶中，加入200 mL去離子水，加入沸石，用電熱套加熱。另一側(cè)在250 mL圓底燒瓶中加入二氯甲烷50 mL，用45 ℃水浴加熱，置于同時蒸餾萃取裝置重相一端。兩邊同時微沸開始計時，保持沸騰2 h。停止加熱后，取下裝有二氯甲烷的燒瓶緩緩打開旋塞回收裝置中的二氯甲烷。置于-20 ℃冰箱中冷凍過夜脫水，用濾紙過濾，并繼續(xù)用無水硫酸鈉過濾除水。隨后用韋氏分餾柱濃縮，55 ℃水浴加熱，控制分流比約30滴/min，待瓶內(nèi)的液體少于5 mL時，停止加熱，靜置使柱內(nèi)溶劑滴下來，轉(zhuǎn)入10 mL離心管，用氮吹儀氮吹濃縮除去大部分二氯甲烷溶劑至2 mL，再過膜轉(zhuǎn)入溶劑瓶中，供GC-MS分析鑒定。

1.2.3 HS-SPME法條件

將固相微萃取頭在氣相色譜儀的進(jìn)樣口經(jīng)270 ℃老化1 h備用；稱取1.2.1中的研碎樣品5 g，放入20 mL頂空瓶中，加入5 mL去離子水和1 g NaCl，加入磁力攪拌轉(zhuǎn)子，密封瓶口；將其置于60 ℃的恒溫水浴鍋內(nèi)磁力攪拌平衡30 min；然后將老化好的萃取頭插入樣品瓶頂空部分，推出萃取頭離液面1 cm處，吸附30 min后取出，隨即插入儀器的進(jìn)樣口，于270 ℃解吸3 min，進(jìn)行數(shù)據(jù)采集分析。

1.2.4 GC-MS分析條件

色譜條件：色譜柱DB-35 MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，載氣為氦氣(純度>99.999%)，進(jìn)樣口溫度270 ℃，柱流速1 mL/min，不分流進(jìn)樣；升溫程序：起始溫度為40 ℃,保持5 min，以6 ℃/min升到85 ℃，保持1.5 min，再以2.5 ℃/min升到150 ℃，保持1 min，最后按20 ℃/min升到280 ℃，保持1 min。質(zhì)譜條件：離子源EI；離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，電子轟擊能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍25～450 amu。

2 結(jié)果與分析

發(fā)酵大豆制品的原材料、發(fā)酵工藝[4]和接種微生物[5]均能對其產(chǎn)品風(fēng)味產(chǎn)生很大影響。在微生物生長的過程中分泌大量的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶酶系，能夠?qū)⒃现械臓I養(yǎng)物質(zhì)水解成脂肪酸、短肽、氨基酸等,進(jìn)而生產(chǎn)大量相應(yīng)雜環(huán)類、醛類、酮類等風(fēng)味化合物。其次臘八豆后發(fā)酵過程中加入的生姜中所含的莰烯、α-姜黃烯等揮發(fā)性成分[6]，以及大蒜中的含硫化合物等也是臘八豆風(fēng)味的重要成分[7]。

2.1 兩種揮發(fā)性物質(zhì)提取方法的比較

本試驗通過SDE法和HS-SPME法兩種方法對4種品牌臘八豆樣品進(jìn)行揮發(fā)性風(fēng)味成分的檢測和分析，相對峰面積≥1%的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)檢測結(jié)果見表1，總共鑒定出115種物質(zhì)，其中SDE法共檢測出98種物質(zhì)，HS-SPME法共檢測出73種物質(zhì)，這些化合物主要分為10類，包括醇類12種，醛類15種，酮類6種，醚類7種，酚類5種，酸類4種，酯類17種，烷烴類40種，含硫類4種和雜環(huán)類5種。

表1 兩種不同提取方法檢測四種不同品牌臘八豆的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相對含量Table 1 Two different extraction methods for detecting the relative content of volatile flavor compounds in four different brands of fermented soybeans

續(xù) 表

續(xù) 表

續(xù) 表

SDE法鑒定出4種臘八豆樣品中各類化合物的相對含量見圖1，這些香氣成分分別占總峰面積的94.4%、87.51%、89.64%、84.52%。共鑒定出物質(zhì)98種，包括醇類12種，醛類13種，酮類5種，醚類6種，酚類3種，酸類3種，酯類14種，烷烴類34種，含硫類3種和雜環(huán)類5種。

圖1 SDE提取臘八豆揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相對含量Fig.1 The relative content of volatile flavor compounds extracted from fermented soybeans by SDE

HS-SPME法鑒定出4種臘八豆樣品中各類化合物的相對含量見圖2，這些香氣成分分別占總峰面積的75.22%、76.41%、77.02%、77.15%。共鑒定出物質(zhì)73種，包括醇類8種，醛類5種，酮類3種，醚類6種，酚類4種，酸類2種，酯類7種，烷烴類31種，含硫類3種和雜環(huán)類4種。分析結(jié)果表明，SDE法比HS-SPME法能較好地檢測出臘八豆中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，特別是醇類、醛類和酯類物質(zhì)。

圖2 HS-SPME提取臘八豆揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相對含量Fig.2 The relative content of volatile flavor compounds extracted from fermented soybeans by HS-SPME

大多數(shù)揮發(fā)物質(zhì)在兩種方法(SDE法和HS-SPME法)中都能檢測到，但是某些物質(zhì)只被其中一種方法檢測到，如正己醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛、棕櫚酸、十四酸乙酯、亞油酸乙酯、硬脂酸乙酯、姜烯、(S)-β-紅沒藥烯、β-倍半水芹烯等物質(zhì)僅在SDE法中被檢測到；丁香酚、4-異丙基環(huán)己烷-1,3-二烯甲醛、(+)-γ-古蕓烯、二十二烷、二十八烷等物質(zhì)僅在HS-SPME法中被檢測到。兩種方法結(jié)合能夠更好地檢測出臘八豆中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。

2.2 臘八豆中主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

4種臘八豆樣品中，JC樣品、LMZ樣品、TYGS樣品、TDJ樣品分別鑒定出73種、66種、77種和77種揮發(fā)性物質(zhì)，檢出次數(shù)較多且含量較豐富的物質(zhì)有芳樟醇、2-茨醇、1-辛烯-3-醇、檸檬醛、甲基庚烯酮、茴香腦、乙基麥芽酚、棕櫚酸乙酯、蒎烯、莰烯、檜烯、α-姜黃烯、正二十烷、正二十一烷、烯丙基二硫等。JC樣品的SDE法檢測出了較高的醇類物質(zhì)，主要是芳樟醇含量很高；HS-SPME法檢測出的乙基麥芽酚含量很高，未檢測出酯類物質(zhì)。LMZ樣品在4種樣品中烷烴類物質(zhì)和酯類物質(zhì)占比最大，用SDE法未鑒定出醚類。TYGS樣品相對于其他樣品含有較多的含硫類物質(zhì)和雜環(huán)類物質(zhì)。TDJ樣品中雜環(huán)類物質(zhì)較其他樣品含量最多，且用HS-SPME法檢測出的酯類物質(zhì)和烷烴類物質(zhì)較其他樣品均較少。

2.2.1 醇類化合物

不飽和醇的閾值相對于直鏈飽和醇的閾值相對較低，對風(fēng)味的形成有較大的貢獻(xiàn)作用[8]。1-辛烯-3-醇天然存在于蘑菇、甜瓜、茶葉、麥芽中[9]，具有草藥味和蘑菇香；2-茨醇又被稱為冰片，有類似樟腦氣味；桉葉油醇具有樟腦氣息和清涼的草藥味道；香茅醇具有玫瑰樣氣味等；芳樟醇具有花香與木香；4-萜烯醇呈暖的胡椒香、較淡的泥土香和陳腐的木材氣息；α-松油醇具似海桐花的清香，甜的紫丁香、鈴蘭氣息[10]，各種醇香相互調(diào)和，賦予了臘八豆特有的風(fēng)味特征[11]。醇類對其他物質(zhì)還具有調(diào)香作用，如與酸反應(yīng)生成酯類。醇是形成多種物質(zhì)的前體物質(zhì)，同時醇也可以使產(chǎn)品具備微甜醇厚的風(fēng)味，是極為重要的風(fēng)味物質(zhì)與風(fēng)味前體物質(zhì)之一[12]。

2.2.2 醛、酮類化合物

醛類的閾值較低，給予食物清香和果香的芳香特質(zhì)，微量的醛可在香氣中起到調(diào)和的作用。在發(fā)酵過程中，醛類化合物可以通過脂質(zhì)過氧化和降解產(chǎn)生[13]，也可以通過氨基酸的Strecker降解產(chǎn)生，也有部分是醛酸途徑的產(chǎn)物。在臘八豆樣品中含量較高的有糠醛、苯乙醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛、橙花醛、檸檬醛等。糠醛、苯甲醛有特殊的杏仁氣味，苯乙醛具有風(fēng)信子香氣，可用于調(diào)配草莓和櫻桃等香精，也能夠賦予醬甜香和水果樣的香氣。直鏈醛類化合物主要是由脂肪氧化降解產(chǎn)生的，具有6個碳原子以上的醛類是脂肪氧化的典型產(chǎn)物[14]。4-異丙基苯甲醛可用作香料，少量用于金合歡、紫羅蘭、風(fēng)倍子、紫丁香、鈴蘭等香型的香精中；(E,E)-2,4-庚二烯醛是典型的亞油酸氧化產(chǎn)物，有桔子和甜橙的香氣，帶有脂肪氣息[15]，主要用于配制雞肉香精及土豆片、柑橘、油炸品和香辛型食品。

酮類物質(zhì)大多是脂肪氧化和Maillard反應(yīng)的產(chǎn)物，一般認(rèn)為酮類物質(zhì)具有清香味、奶油氣味和果香味。本實驗檢測出的酮類物質(zhì)共有6種，3-乙?；?4-羥基-6-甲基-2H-吡喃-2-酮含量較高，甲基庚烯酮具有檸檬草的香氣，在大多數(shù)樣品中都能檢測到。酮類物質(zhì)閾值較醛類物質(zhì)高，且檢測出的酮類物質(zhì)含量和種類均較少，對臘八豆的貢獻(xiàn)可能相對較小。

2.2.3 醚、酚類化合物

雖然醚類化合物的相對含量比較低，但其對臘八豆香味成分的貢獻(xiàn)不容忽略。其中，含量相對較高的烯丙基甲基二硫醚有茴香和草香香氣，有增加香味的效果。二烯丙基三硫醚具有大蒜味與沖鼻氣味。

發(fā)酵豆制品中的酚類物質(zhì)雖然含量極微，但作為香氣成分作用十分明顯，很容易被察覺[16]。檢出的酚類如乙基麥芽酚具有持久的焦糖和水果香氣，是一種食品添加劑，丁香酚有像丁香的氣味，2,4-二叔丁基苯酚是一種增塑劑。

2.2.4 酸類化合物

在臘八豆樣品中共檢測出4種酸類，分別是2-氨基-5-甲基苯甲酸、脫氫乙酸、棕櫚酸和亞油酸。脫氫乙酸可能是由乙酸脫氫生成，乙酸還可以合成乙酸酯類物質(zhì)，增加臘八豆香氣，有機(jī)酸可以調(diào)節(jié)食物味道，使整體味道更加柔和[17]。微生物生長分泌的酶可以將大豆中油脂分解成長鏈脂肪酸，脂肪酸本身氧化降解和氨基酸降解后經(jīng)氧化或還原作用可以生成低級酸類物質(zhì)，酸類物質(zhì)具有刺激性氣味，能調(diào)和臘八豆的風(fēng)味[18]。

2.2.5 酯類化合物

酯類化合物是傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬香氣不可缺少的重要組成部分。酯類化合物多數(shù)由細(xì)菌產(chǎn)生的有機(jī)酸和酵母產(chǎn)生的醇在酯化酶的催化下形成[19]。如乳酸乙酯、己酸乙酯等，呈現(xiàn)出微帶果香的酒香，是構(gòu)成醬香味的主體成分，可以由酵母酶催化生成，也可以通過有機(jī)酸和醇的酯化反應(yīng)生成。豆類發(fā)酵食品中還含有亞油酸乙酯、十六酸乙酯、棕櫚酸乙酯、硬脂酸乙酯等酯類成分，可使臘八豆的香氣更豐富[20]。同時酯類還可以緩沖發(fā)酵豆制品中鹽分的咸味。

2.2.6 烷烴類化合物

檢測出的風(fēng)味物質(zhì)中，烷烴類的種類和含量都相對較高,包括C12～C28的烷烴以及一些支鏈烯烴等，其中有25種烷烴類在兩種檢測方法中均存在，另外SDE法檢測出單獨的10種，HS-SPME法檢測出單獨的6種，SDE法在提取過程中長時間的高溫蒸餾可能得到較多的長鏈烴[21]。

蒎烯、莰烯、水芹烯、檜烯、萜品油烯、β-欖香烯、順式-β-金合歡烯、(-)-α-蓽澄茄油烯、α-姜黃烯、姜烯、(S)-β-紅沒藥烯、β-倍半水芹烯等含量較高的烯烴在SDE法中幾乎都檢測到，其中α-姜黃烯在HS-SPME法中也都能檢測到。α-蒎烯是無色透明液體，有松節(jié)油氣味，是各種萜烯類合成香料的主要起始原料；α-姜黃烯存在于白肋煙葉中；水芹烯有黑胡椒、薄荷香氣。烯烴化合物閾值較低，對臘八豆風(fēng)味的貢獻(xiàn)相對較大，也是一類主要的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，而烷烴類化合物閾值較高，對臘八豆的風(fēng)味貢獻(xiàn)較小[22]，但可能有助于提高臘八豆的整體風(fēng)味。它們主要來源于脂肪酸烷氧自由基的均裂，正構(gòu)烷烴可能來自脂肪的自動氧化，支鏈烷烴可能來自支鏈脂肪酸的氧化[23]。檢測出的烷類物質(zhì)主要包括正十六烷、正十八烷、3-甲基十八烷、正二十烷、正二十一烷、正二十七烷等。正二十七烷主要存在于烤煙、白肋煙、香料煙煙葉和煙氣中[24]。烷烴類物質(zhì)一般是合成大分子物質(zhì)的基礎(chǔ)成分，也是合成某些香料的重要原料。

2.2.7 含硫、雜環(huán)類化合物

含硫化合物主要來源于含硫氨基酸的分解[25]。一般而言，含硫香料化合物是各類香料化合物中閾值最低的一類，在濃度很低時就可以產(chǎn)生令人愉快的食品香味，它們對食品的特征香味有很大的影響[26]。

雜環(huán)化合物是典型的呈香化合物，對發(fā)酵豆制品的風(fēng)味影響也很大。雜環(huán)化合物來源于氨基酸和還原糖的Maillard反應(yīng)，以及氨基酸的熱分解等[27]。含量較高的有3,4-二甲基噻吩、含硫雜環(huán)化合物等。在發(fā)酵豆制品中含量雖然不高，但仍與微生物的生長代謝息息相關(guān)，也是臘八豆風(fēng)味成分中不可或缺的物質(zhì)。

3 結(jié)論

本研究采用SDE法和HS-SPME法與GC-MS聯(lián)用分析4種臘八豆的揮發(fā)性風(fēng)味成分，結(jié)果表明，兩種不同的提取方式檢測到的物質(zhì)的種類與含量均不同，SDE法比HS-SPME法能較好地檢測出醇類、醛類和酯類物質(zhì)，且SDE法檢出的物質(zhì)相對峰面積均高于SPME法，但也有一部分物質(zhì)只能被SDE法或HS-SPME法檢測到，兩種方法結(jié)合可以更好地檢測出臘八豆中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。

不同品牌的臘八豆因為原料、菌種、生產(chǎn)工藝的不同，其相關(guān)的風(fēng)味指標(biāo)也有差異，JC樣品中醇類物質(zhì)含量較高，LMZ樣品中酯類物質(zhì)含量較高，TYGS樣品中含硫類和雜環(huán)類物質(zhì)含量較高，TDJ樣品中雜環(huán)類物質(zhì)含量較高，但4種樣品中烷烴類物質(zhì)含量都很高。主要的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)在4種樣品中幾乎都能檢測到。1-辛烯-3-醇、桉葉油醇、芳樟醇、2-茨醇、α-松油醇、糠醛、苯乙醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛、橙花醛、檸檬醛、甲基庚烯酮、烯丙基甲基二硫醚、乙基麥芽酚、丁香酚、棕櫚酸乙酯、蒎烯、莰烯、檜烯、α-姜黃烯、正二十烷、正二十一烷等物質(zhì)對臘八豆的風(fēng)味有重要貢獻(xiàn)作用，為進(jìn)一步確定臘八豆風(fēng)味成分的研究提供了基礎(chǔ)。