鄧愛鳳,梁麗萍,張光輝
深圳恒生醫(yī)院檢驗(yàn)科,廣東 深圳 510180
腦卒中是一種腦血管意外,又稱中風(fēng),是由遺傳因素及環(huán)境因素等多種誘發(fā)因素所共同作用導(dǎo)致的一種永久性的腦功能障礙,臨床表現(xiàn)為腦部供血受阻,導(dǎo)致患者腦部動(dòng)脈狹窄、閉塞、破裂,引發(fā)急性腦血壓循環(huán)異常,臨床上具有較高的發(fā)病率、病殘率及病死率[1-2]。根據(jù)相關(guān)臨床資料顯示,中國腦卒中患者病死率為58/10萬~142/10萬,是導(dǎo)致人類死亡的三大死因之一,嚴(yán)重影響人們的生命健康[3]。因此,對腦卒中病因的研究以及預(yù)防成為臨床治療研究的重點(diǎn)。根據(jù)臨床研究顯示,腦卒中的發(fā)病與高同型半胱氨酸 (Hcy) 血癥密切相關(guān),是引發(fā)腦卒中的獨(dú)立性危險(xiǎn)因素[4]。葉酸、維生素B12或維生素B6攝入量過少或代謝過程中酶或因子發(fā)生異常,易引發(fā)高Hcy 血癥。影響高Hcy 血癥的眾多因素中較為重要的代謝關(guān)鍵酶是N5、N10亞甲基四氫葉酸還原酶 (MTHFR) ,MTHFR 多基因多態(tài)性對酶的特異活性作用很大,當(dāng)MTHFR基因突變時(shí),導(dǎo)致MTHFR酶活性降低,使Hcy濃度升高及DNA 低甲基化,從而導(dǎo)致輕度或中度高Hcy血癥,引發(fā)多種疾病[5-6]。本文回顧性分析腦卒中患者中血漿MTHFR基因多態(tài)性及HCY、葉酸、維生素B12水平的變化,并探討其對腦卒中的診斷價(jià)值。
1.1 一般資料 選取2018 年6 月至2019 年6 月在深圳恒生醫(yī)院接受治療且符合腦卒中臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)的患者300 例作為觀察組,其中缺血性腦卒中181例,出血性腦卒中119 例;另選擇同期體檢健康者300例作為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn):①腦卒中患者均符合中國急性缺血性腦卒中診治指南標(biāo)準(zhǔn),并經(jīng)CT 或MRI 檢查確診;正常健康體檢者均符合無血緣關(guān)系且無其他腦梗死或腦血管疾病癥狀;②近期 (1個(gè)月內(nèi)) 無感染癥狀且未使用影響血漿Hcy水平的藥物,如甲氨蝶呤、葉酸以及B族維生素類代謝等;③無占位性病變者。排除標(biāo)準(zhǔn):①合并冠心病、糖尿病等疾病者;②具有心源性腦栓塞、肝腎功能嚴(yán)重不全及惡性腫瘤等疾病者;③甲狀腺功能損傷、免疫性疾病或血液系統(tǒng)疾病者;④具有長時(shí)間貧血史或胃潰瘍病史者。兩組受檢者的一般資料比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05) ,具有可比性,見表1。
表1 兩組患者的基本資料比較[例 (%) ]
1.2 觀察指標(biāo) (1) 兩組受檢者的血漿Hcy水平、葉酸、維生素B12水平及收縮壓、舒張壓、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白 (LDL) 、高密度脂蛋白 (HDL) 等指標(biāo); (2) 兩組受檢者的血漿MTHFR 基因多態(tài)性分型以及不同基因分型者的血漿Hcy水平; (3) 兩組受檢者血漿MTHFR基因型及等位基因頻率分布情況。
1.3 檢測方法
1.3.1 血漿Hcy、葉酸、維生素B12水平測定 循環(huán)酶法測定Hcy,取所有受檢者空腹靜脈血5 mL,采血須一次成功,置于乙二胺四乙酸抗凝管中,抗凝處理10 min 后,采用2%乙二胺四乙酸二鈉100 μL 進(jìn)行分離,4℃3 000 r/min 離心分離上層血漿,標(biāo)本置于-70℃環(huán)境保存待測;檢測儀器采用日本Hitch 7080全自動(dòng)生化分析儀,德國西門子公司提供的相關(guān)試劑盒,根據(jù)操作說明測定Hcy水平;采用德國西門子公司ADVIA Centaur XP 全自動(dòng)免疫分析儀及相關(guān)試劑盒測定葉酸、維生素B12。血漿Hcy 濃度小于10 μmol/L時(shí)為正常值,10 μmol/L以上為高Hcy 血癥。
1.3.2 MTHFR 基因分型檢測 (1) 首先需提取DNA,取所有受試者靜脈血2 mL,經(jīng)EDTA抗凝處理,根據(jù)DNA 提取試劑操作說明方法完成提取和純化,樣本DNA 置于-20℃保存,凍融小于3 次; (2) 其次對純化后的DNA 標(biāo)本進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,適用0.2 mL 的擴(kuò)增反應(yīng)管分裝MTHFR擴(kuò)增液,擴(kuò)增反應(yīng)體系共25 μL (19 μL 擴(kuò)增液、1 μL 反應(yīng)液、5 μL DNA 模板) ,在94℃中預(yù)變10 min,進(jìn)行95℃變性30 s、57℃退火45 s、72℃延伸45 s循環(huán)25次,在72℃延伸5 min時(shí)停止;擴(kuò)增后置于2℃~8℃環(huán)境保存; (3) 最后進(jìn)行雜交、顯色,取出擴(kuò)增液產(chǎn)物10 μL 與雜交緩沖液進(jìn)行混合,取抗體1支進(jìn)行低速離心,對抗體進(jìn)行稀釋,取出標(biāo)記好的MTHFR基因芯片進(jìn)行雜交,采用基因芯片圖像分析軟件進(jìn)行掃描圖像,分析數(shù)據(jù),觀察MTHFR 677 位點(diǎn)的等位基因,分別定義為C/C、C/T、T/T三種分型。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料符合正態(tài)分布,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn),以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 兩組受檢者的血漿Hcy水平等指標(biāo)比較 觀察組患者的血漿Hcy水平明顯高于對照組,葉酸、維生素B12水平明顯低于對照組,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05) ;觀察組患者收縮壓明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05) ,但舒張壓、總膽固醇、甘油三酯、LDL、HDL組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05) ,見表2。
表2 兩組受檢者的血漿Hcy水平等指標(biāo)比較
表2 兩組受檢者的血漿Hcy水平等指標(biāo)比較
注:1 mmHg=0.133 kPa。
組別例數(shù)觀察組對照組t值P值300 300 Hcy (μmol/L) 19.89±8.78 12.88±5.93 11.459 9<0.05葉酸 (ng/mL) 5.62±1.34 7.32±3.53 7.798 4<0.05維生素B12 (pg/mL) 347.82±125.32 476.43±122.65 12.703 6<0.05收縮壓 (mmHg) 150.22±25.24 130.43±12.54 12.162 2<0.05舒張壓 (mmHg) 85.62±13.44 84.43±15.43 1.007 3 0.314 2總膽固醇 (mmol/L) 6.47±2.36 6.72±1.13 1.654 9 0.098 5甘油三酯 (mmol/L) 1.62±0.24 1.59±0.64 0.760 2 0.4474 LDL (mmol/L) 4.42±2.55 4.32±2.63 0.472 8 0.636 5 HDL (mmol/L) 1.32±0.48 1.33±0.43 0.268 8 0.788 2
2.2 兩組受檢者的血漿MTHFR基因分布頻率比較 經(jīng)Hardy-Weinberg平衡定律檢測觀察組MTHFR等位基因分布的頻率,其中C/C、C/T、T/T 實(shí)際頻數(shù)分別為90、129、81,預(yù)計(jì)頻數(shù)分別為89、131、80,數(shù)據(jù)均符合平衡定律 (χ2=3.347 8,P=0.067 5) ,表示均來自孟德爾群體。觀察組C/C基因型頻率及C等位基因頻率明顯低于對照組,T/T 基因型頻率及T 等位基因頻率明顯高于對照組,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05) ;觀察組患者的C/T 基因型頻率略高于對照組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05) ,見表3。
表3 兩組受檢者的血漿MTHFR基因分布頻率比較[例 (%) ]
2.3 兩組受檢者的不同基因分型血漿Hcy水平比較 兩組受檢者的T/T基因型血漿Hcy水平明顯高于C/C、C/T 基因型,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05) ;觀察組患者的C/C、C/T、T/T基因型血漿Hcy水平明顯高于對照組,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05) ,見表4。
表4 兩組受檢者的不同基因分型血漿Hcy水平比較,μmol/L)
表4 兩組受檢者的不同基因分型血漿Hcy水平比較,μmol/L)
注:與T/T基因型比較,aP<0.05。
組別觀察組對照組t值P值例數(shù)300 300 C/C 14.89±4.78a 12.88±4.93a 5.069 9<0.05 C/T 16.62±4.34a 13.32±3.53a 10.217 1<0.05 T/T 26.82±7.32 24.43±5.65 4.476 8<0.05
腦卒中即腦血管疾病患者因遺傳因素、環(huán)境因素等多種因素誘發(fā),導(dǎo)致患者腦血管出現(xiàn)供血不足、閉塞或破裂現(xiàn)象,腦功能嚴(yán)重?fù)p傷,且腦卒中病情發(fā)展迅速,發(fā)病率高且發(fā)病后具有較高的致死率[7]。因此,近些年有關(guān)腦卒中的預(yù)防和評估一直是臨床治療腦卒中研究的熱點(diǎn)。根據(jù)有關(guān)資料顯示,高HCY血癥是形成血栓的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,可能機(jī)制是HCY升高能夠造成內(nèi)皮細(xì)胞損傷,平滑肌細(xì)胞質(zhì)增殖,血小板活性增強(qiáng),通過氧化應(yīng)激反應(yīng),凝血激酶升高,抗凝血蛋白下降,從而促進(jìn)腦卒中病情的產(chǎn)生和發(fā)展[8-9]。
本研究結(jié)果顯示,腦卒中患者與正常健康受試者的血壓狀況及總膽固醇、甘油三酯、LDL、HDL 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而腦卒中患者的血漿Hcy 明顯較高,而葉酸、維生素B12水平明顯較低。研究結(jié)果證實(shí)了上述理論,這提示當(dāng)機(jī)體Hcy 水平升高時(shí)會(huì)導(dǎo)致生成氧自由基,血管內(nèi)皮細(xì)胞受損,從而使一氧化氮和前列環(huán)素合成降低,低密度脂蛋白氧化,血小板功能障礙,形成泡沫細(xì)胞,抑制腦血管動(dòng)脈彈性,從而使血管阻力加大,增加腦血管血栓的風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí),葉酸、維生素B12水平作為輔酶一旦缺乏也會(huì)導(dǎo)致Hcy水平升高,極易引起血管栓塞性事件的發(fā)生,這可能在于血漿Hcy 作為一種中間產(chǎn)物氨基酸,作用于人體甲硫氨酸循環(huán)中,主要通過再甲基化和轉(zhuǎn)硫兩種途徑完成代謝過程,完成代謝過程需要MTHFR、葉酸、輔酶維生素B12共同作用。
此外,本研究發(fā)現(xiàn)MTHFR 基因多態(tài)性分布頻率,結(jié)果顯示腦卒中患者相較于正常健康者具有更高的T/T基因型頻率及T等位基因頻率,而C/C基因型頻率及C等位基因頻率顯著較低。這提示血漿Hcy代謝過程以5-甲基四氫葉酸作為甲基供體,能夠經(jīng)MTR 作用重新合成甲硫氨酸,其中葉酸是轉(zhuǎn)化5-甲基四氫葉酸的關(guān)鍵成分,MTHFR 能夠催化形成5、10-亞甲基四氫葉酸還原成N5-甲基四氫葉酸,因此MTHFR基因是Hcy 代謝中的關(guān)鍵酶。MTHFR 基因常見的酶缺陷是指MTHFR基因序列677 位點(diǎn)的點(diǎn)突變,發(fā)生由C 到T 的變化,導(dǎo)致丙氨酸變?yōu)槔i氨酸,使MTHFR 酶活性降低約65%,與葉酸結(jié)合能力下降,增加血栓形成風(fēng)險(xiǎn)[13-14]。一旦MTHFR出現(xiàn)含量不足或活性降低,引發(fā)Hcy代謝不足,體內(nèi)聚集,Hcy升高,引起高Hcy血癥,從而導(dǎo)致腦卒中風(fēng)險(xiǎn)升高[15]。
根據(jù)臨床研究資料,C/C基因型的MTHFR酶的活性最高,C/T 基因型的活性中等,活性約為正常的65%,T/T基因型活性最低,活性約為正常的30%[18-19]。本研究結(jié)果證實(shí)了上述理論,根據(jù)不同基因分型Hcy 水平結(jié)果顯示,T/T 基因型血漿Hcy 水平明顯高于C/C、C/T 基因型,同時(shí)腦卒中患者的三種分型的血漿Hcy 水平均高于正常健康者,這提示腦卒中MTHFR基因的活性下降,導(dǎo)致Hcy再甲基化作用過程中出現(xiàn)代謝障礙,Hcy 水平升高,從而增加腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)[20]。
綜上所述,血漿MTHFR基因多態(tài)性、Hcy 水平與腦卒中的發(fā)生具有一定的關(guān)系,臨床上檢測兩種指標(biāo)可以有助于及時(shí)提供針對性的預(yù)防和個(gè)體化治療方案。