曹海鵬，楊麗君，陳思佳，郭 成，楊先樂

( 1.上海海洋大學，國家水生動物病原庫，上海 201306； 2.上海海洋大學，上海水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術研究中心， 上海 201306； 3.上海海洋大學，水產(chǎn)動物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 201306； 4.上海海洋大學，水產(chǎn)科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306 )

近年來，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖的不斷發(fā)展，抗菌藥在水產(chǎn)飼料及水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應用也越來越廣泛，有效地控制了很多水產(chǎn)疾病的發(fā)生，極大地促進了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，但由此也引起了致病菌耐藥性增強而使抗菌藥面臨著療效明顯下降甚至無效等難題[1]。聯(lián)合用藥與合理配伍是增強抗菌藥療效、減少細菌耐藥性的有效手段[2]。合理有效的聯(lián)用抗菌藥能增強抗菌活性，降低毒性，延緩或避免耐藥菌株的產(chǎn)生，從而延長抗菌藥的使用壽命，對致病菌的臨床控制具有重要意義[2-3]。海藻希瓦菌(Shewanellaalgae)為革蘭氏陰性菌，廣泛分布于水產(chǎn)品、奶制品、水源、土壤中，為人魚共患病的重要致病菌，危害極大。近年來，海藻希瓦菌引起的人類椎間盤炎[4]、敗血癥[5]以及眼斑擬石首魚(Sciaenopsocellatus)潰瘍病[6]、腎腫大癥[7]、東風螺(Babylonia)吻腫病[8]、凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)黑斑病[9]等病例相繼被報道，對人類健康與養(yǎng)殖生產(chǎn)構成了重大的威脅。研究表明，海藻希瓦菌對硫酸慶大霉素、頭孢類抗菌藥高度敏感[5]，但如何對硫酸慶大霉素和頭孢噻肟鈉進行聯(lián)合使用與合理配伍卻鮮有研究，這很大程度上影響了這些藥物對海藻希瓦菌有效控制的穩(wěn)定性。鑒于此，本試驗以甲砜霉素、多西環(huán)素、噁喹酸、磺胺間甲氧嘧啶鈉、磺胺甲噁唑、鹽酸恩諾沙星等6種漁用抗菌藥[10-11]作為對照，比較測定硫酸慶大霉素、頭孢噻肟鈉對水產(chǎn)致病性海藻希瓦菌的體外抗菌作用，并在此基礎上進一步評價硫酸慶大霉素和頭孢噻肟鈉在不同復配比例下對海藻希瓦菌SFH3的體外聯(lián)合抑菌效果，通過時間—殺菌曲線法測定其體外聯(lián)合殺菌效果，以期為水產(chǎn)致病性海藻希瓦菌的控制提供聯(lián)合用藥與合理配伍依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

海藻希瓦菌SFH3，分離自患黑斑病的凡納濱對蝦[9]，由國家水生動物病原庫提供；硫酸慶大霉素(有效含量≥98.5%，浙江先鋒化工制藥有限公司)；頭孢噻肟鈉(有效含量≥98.5%，大連容海生物科技有限公司)；甲砜霉素(有效含量≥98%，華北制藥股份有限公司)；多西環(huán)素(有效含量≥98%，華北制藥股份有限公司)；噁喹酸(有效含量≥98%，大連容海生物科技有限公司)；磺胺間甲氧嘧啶鈉(有效含量≥98%，華北制藥股份有限公司)；磺胺甲噁唑(有效含量≥98%，佛山市南海北沙制藥有限公司)；鹽酸恩諾沙星(有效含量≥98%，華北制藥股份有限公司)。

1.2 致病性海藻希瓦菌菌懸液的制備

將斜面保藏的海藻希瓦菌SFH3在無菌條件下接種于營養(yǎng)瓊脂斜面，32 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h后，用無菌生理鹽水洗下營養(yǎng)瓊脂斜面上的菌苔，用稀釋涂布平板法測定并調節(jié)菌懸液密度為5.0×108cfu/mL。

1.3 抗菌藥藥液的制備

參照文獻[12]的方法進行抗菌藥藥液的制備。即準確稱取各抗菌藥256 mg，加入無菌蒸餾水100 mL溶解后即為質量濃度2560 mg/L抗菌藥藥液，經(jīng)孔徑為0.22 μm微孔過濾器過濾除菌，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 硫酸慶大霉素和頭孢噻肟鈉對海藻希瓦菌的體外抑菌作用分析

1.4.1 硫酸慶大霉素最小抑菌質量濃度的測定

試驗設3個平行，采用試管二倍稀釋法[13-14]測定硫酸慶大霉素對海藻希瓦菌SFH3的最小抑菌質量濃度(MIC)。即取含有2 mL無菌營養(yǎng)肉湯的試管13支并編號，于第1管中加入2 mL硫酸慶大霉素藥液至終質量濃度為1280 mg/L，混勻后再取2 mL加入第2管中至終質量濃度為640 mg/L，依次倍比稀釋直至第12管(其中2 mL棄用)，至終質量濃度分別為320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625 mg/L，第13管為陽性對照，不加硫酸慶大霉素藥液，然后分別接種海藻希瓦菌SFH3至終密度為5.0×105cfu/mL，于32 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后觀察結果。以相同培養(yǎng)條件的空白無菌營養(yǎng)肉湯作為陰性對照。將肉眼觀察培養(yǎng)液澄清透明的硫酸慶大霉素最低質量濃度作為最小抑菌質量濃度[15]。以相同試驗條件下甲砜霉素、多西環(huán)素、噁喹酸、磺胺間甲氧嘧啶鈉、磺胺甲噁唑、鹽酸恩諾沙星對海藻希瓦菌SFH3的最小抑菌質量濃度作為對照。

1.4.2 頭孢噻肟鈉最小抑菌質量濃度的測定

試驗設3個平行，采用試管二倍稀釋法[13-14]測定頭孢噻肟鈉對海藻希瓦菌SFH3的最小抑菌質量濃度。即取含有2 mL無菌營養(yǎng)肉湯的試管13支并編號，于第1管中加入2 mL頭孢噻肟鈉藥液至終質量濃度為1280 mg/L，混勻后再取2 mL加入第2管中至終質量濃度為640 mg/L，依次倍比稀釋直至第12管(其中2 mL棄用)，至終質量濃度分別為320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625 mg/L，第13管為陽性對照，不加頭孢噻肟鈉藥液，然后分別接種海藻希瓦菌SFH3至終密度為5.0×105cfu/mL，于32 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后觀察結果。以相同培養(yǎng)條件的空白無菌營養(yǎng)肉湯作為陰性對照。將肉眼觀察培養(yǎng)液澄清透明的頭孢噻肟鈉最低質量濃度作為最小抑菌質量濃度[15]。以相同試驗條件下甲砜霉素、多西環(huán)素、噁喹酸、磺胺間甲氧嘧啶鈉、磺胺甲噁唑、鹽酸恩諾沙星對海藻希瓦菌SFH3的最小抑菌質量濃度作為對照。

1.5 硫酸慶大霉素和頭孢噻肟鈉在不同復配比例下對海藻希瓦菌的體外聯(lián)合抑菌效果分析

試驗設3個平行，以不同的配比(表1)將硫酸慶大霉素和頭孢噻肟鈉進行復配，復配后的硫酸慶大霉素和頭孢噻肟鈉混合藥物總質量為256 mg，然后參照1.3的方法制成硫酸慶大霉素和頭孢噻肟鈉混合藥液后，采用試管二倍稀釋法[13-14]測定復配的硫酸慶大霉素和頭孢噻肟鈉對海藻希瓦菌SFH3的最小抑菌質量濃度，即取含有2 mL無菌營養(yǎng)肉湯的試管13支并編號，于第1管中加入2 mL硫酸慶大霉素和頭孢噻肟鈉混合藥液至質量濃度為1280 mg/L，混勻后再取2 mL加入第2管中至終質量濃度為640 mg/L，依次倍比稀釋直至第12管(其中2 mL棄用)，分別至質量濃度為320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625 mg/L，第13管為陽性對照，不加硫酸慶大霉素和頭孢噻肟鈉混合藥液，然后分別接種海藻希瓦菌SFH3至終密度5.0×105cfu/mL，于32 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后觀察結果。以相同培養(yǎng)條件的空白無菌營養(yǎng)肉湯作為陰性對照。將肉眼觀察培養(yǎng)液澄清透明的硫酸慶大霉素和頭孢噻肟鈉混合藥液的最低質量濃度作為最小抑菌質量濃度[15]。采用分級抑制濃度(FIC)指數(shù)對復配的硫酸慶大霉素和頭孢噻肟鈉的聯(lián)合抑菌效果進行評價。FIC指數(shù)按下式計算[16]：

FIC指數(shù)=a1/a2+b1/b2

式中，a1、a2分別為甲藥聯(lián)用、甲藥單用時的最小抑菌質量濃度，b1、b2分別為乙藥聯(lián)用、乙藥單用時的最小抑菌質量濃度。

FIC指數(shù)的判斷標準[17]：FIC指數(shù)≤0.5，協(xié)同作用；0.5

表1 硫酸慶大霉素和頭孢噻肟鈉的復配比例Tab.1 Mixed proportion of gentamycin sulfate and cefotaxime sodium

1.6 硫酸慶大霉素和頭孢噻肟鈉對海藻希瓦菌的體外聯(lián)合殺菌效果分析

試驗設3個平行，參照文獻[18]的時間—殺菌曲線法測定硫酸慶大霉素和頭孢噻肟鈉對海藻希瓦菌SFH3的體外聯(lián)合殺菌效果。即取含有5 mL無菌營養(yǎng)肉湯的試管5支并編號，于第1管中同時加入終質量濃度為1/2最小抑菌質量濃度的硫酸慶大霉素和終質量濃度為1/2最小抑菌質量濃度的頭孢噻肟鈉，于第2管中加入終質量濃度為1/2最小抑菌質量濃度的硫酸慶大霉素，于第3管中加入終質量濃度為1/2最小抑菌質量濃度的頭孢噻肟鈉，第4管為陰性對照，不加任何抗菌藥，然后分別接種海藻希瓦菌SFH3至終密度5.0×105cfu/mL，于32 ℃恒溫培養(yǎng)，分別在0、12、24、36、48、60、72 h取樣并采用稀釋涂布平板計數(shù)法測定海藻希瓦菌SFH3的密度。以培養(yǎng)時間為橫坐標、密度的對數(shù)值為縱坐標繪制殺菌曲線。聯(lián)合殺菌效果的判斷標準[19]：聯(lián)合用藥組的菌密度對數(shù)值較藥物單用組均降低超過2 log(cfu/mL)時，則判斷藥物聯(lián)用具有協(xié)同效果；降低1～2 log(cfu/mL)時，則判斷藥物聯(lián)用具有相加效果；降低1 log(cfu/mL)及以下時，則判斷藥物聯(lián)用具有無相關效果。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

所有試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0軟件進行處理分析，以平均值±標準差表示。

2 結 果

2.1 硫酸慶大霉素和頭孢噻肟鈉對海藻希瓦菌的體外抑菌作用

試驗結果表明，相對于甲砜霉素、多西環(huán)素、噁喹酸、磺胺間甲氧嘧啶鈉、磺胺甲噁唑、鹽酸恩諾沙星等漁用抗菌藥，硫酸慶大霉素和頭孢噻肟鈉對海藻希瓦菌SFH3表現(xiàn)出較好的抑菌效果(表2)。其中，硫酸慶大霉素和頭孢噻肟鈉對海藻希瓦菌SFH3的最小抑菌質量濃度分別為80 mg/L和160 mg/L，而甲砜霉素、多西環(huán)素、噁喹酸、磺胺間甲氧嘧啶鈉、磺胺甲噁唑、鹽酸恩諾沙星等抗菌藥對海藻希瓦菌SFH3的最小抑菌質量濃度均大于1280 mg/L。

表2 抗菌藥對海藻希瓦菌SFH3的最小抑菌質量濃度Tab.2 Minimum inhibitory concentration (MIC) of antimicrobials against S. algae strain SFH3

注：ND表示不確定(最小抑菌質量濃度>1280 mg/L).

Note: ND indicates uncertain (MIC>1280 mg/L).

2.2 硫酸慶大霉素和頭孢噻肟鈉在不同復配比例下對海藻希瓦菌的體外聯(lián)合抑菌效果

試驗結果表明，硫酸慶大霉素和頭孢噻肟鈉聯(lián)用有利于增強對海藻希瓦菌SFH3的抑菌活性(圖1)。其中，硫酸慶大霉素和頭孢噻肟鈉對海藻希瓦菌SFH3的聯(lián)合抑菌效果最佳配比為8∶2和7∶3，對海藻希瓦菌SFH3的最小抑菌質量濃度均為40 mg/L，較硫酸慶大霉素和頭孢噻肟鈉單用時對海藻希瓦菌SFH3 的最小抑菌質量濃度降低了50%和75%；其次的配比為9∶1和6∶4，對海藻希瓦菌SFH3的最小抑菌質量濃度為53 mg/L，較硫酸慶大霉素和頭孢噻肟鈉單用時對海藻希瓦菌SFH3的最小抑菌質量濃度降低了34%和67%；再次的配比是4∶6和3∶7，對海藻希瓦菌SFH3的最小抑菌質量濃度為67 mg/L，較硫酸慶大霉素和頭孢噻肟鈉單用時對海藻希瓦菌SFH3的最小抑菌質量濃度降低了16%和58%。此外，測定了硫酸慶大霉素和頭孢噻肟鈉在不同的復配比例下的FIC指數(shù)(表3)，硫酸慶大霉素和頭孢噻肟鈉按8∶2、7∶3比例進行復配時，F(xiàn)IC指數(shù)小于0.5，對海藻希瓦菌SFH3的體外抑菌作用表現(xiàn)為協(xié)同作用；硫酸慶大霉素和頭孢噻肟鈉按9∶1、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9比例進行復配時，F(xiàn)IC指數(shù)為0.5～1，對海藻希瓦菌SFH3的體外抑菌作用則表現(xiàn)為相加作用。

圖1 不同復配比例的硫酸慶大霉素和頭孢噻肟鈉 對海藻希瓦菌SFH3的最小抑菌質量濃度Fig.1 Minimum inhibitory concentration (MIC) of the combined use of gentamycin sulfate and cefotaxime sodium at different mixed proportions

表3 硫酸慶大霉素和頭孢噻肟鈉聯(lián)用的FIC指數(shù)Tab.3 Fractional inhibitory concentration (FIC) index of the combined use of gentamycin sulfate and cefotaxime sodium

2.3 硫酸慶大霉素和頭孢噻肟鈉對海藻希瓦菌的體外聯(lián)合殺菌效果

硫酸慶大霉素和頭孢噻肟鈉對海藻希瓦菌SFH3的時間—殺菌曲線見圖2。試驗結果表明，不添加任何抗菌藥的陰性對照組中，海藻希瓦菌SFH3的密度在培養(yǎng)72 h后較初始值增加了2.95 log(cfu/mL)，相同條件下僅添加40 mg/L(1/2最小抑菌質量濃度)硫酸慶大霉素的試驗組中，海藻希瓦菌SFH3的密度較初始值增加了1.51 log(cfu/mL)，僅添加80 mg/L(1/2最小抑菌質量濃度)頭孢噻肟鈉的試驗組中，海藻希瓦菌SFH3的密度較初始值降低了0.24 log(cfu/mL)，而同時添加40 mg/L(1/2最小抑菌質量濃度)硫酸慶大霉素和80 mg/L(1/2最小抑菌質量濃度)頭孢噻肟鈉的試驗組中海藻希瓦菌SFH3的密度降低了1.78 log(cfu/mL)，分別較添加40 mg/L(1/2最小抑菌質量濃度)硫酸慶大霉素的試驗組和80 mg/L(1/2最小抑菌質量濃度)頭孢噻肟鈉的試驗組降低了3.29 log(cfu/mL)和2.02 log(cfu/mL)，說明40 mg/L硫酸慶大霉素和80 mg/L頭孢噻肟鈉對海藻希瓦菌SFH3的體外聯(lián)合殺菌作用具有協(xié)同效果。

圖2 硫酸慶大霉素和頭孢噻肟鈉對海藻希瓦菌SFH3的 時間—殺菌曲線Fig.2 Time-killing curve of gentamycin sulfate and cefotaxime sodium against S. algae strain SFH3

3 討 論

3.1 致病性海藻希瓦菌潛在控制藥物研究應給予重視

人魚共患致病菌作為引發(fā)食源性疾病的重要因素，嚴重威脅人類的健康。2012年上海閔行區(qū)曾發(fā)生了上百起因水產(chǎn)品中副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)污染引起的腹瀉[20]。因此，研究人魚共患致病菌對預防和控制食源性疾病具有重要的現(xiàn)實意義。目前，嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)、副溶血弧菌、霍亂弧菌(V.cholerae)、遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)等人魚共患致病菌已經(jīng)引起研究者的高度重視，并開展了相應的藥物控制技術研究工作[21-26]，但作為人魚共患致病菌的海藻希瓦菌的藥物控制技術研究卻鮮見詳細報道。因此，筆者研究了硫酸慶大霉素和頭孢噻肟鈉對水產(chǎn)致病性海藻希瓦菌SFH3的體外聯(lián)合抗菌效果，旨在為致病性海藻希瓦菌的潛在控制藥物提供理論參考。

3.2 硫酸慶大霉素和頭孢噻肟鈉對海藻希瓦菌體外抑菌效果分析方法的選擇

抗菌藥體外抑菌效果的分析方法主要包括試管二倍稀釋法[13]、藥敏紙片法[27]、平皿二倍稀釋法[28]和微孔板稀釋法[29]等。其中，試管二倍稀釋法是一種精確定量的方法，不僅能夠直接測定抗菌藥對病原菌的最小抑菌質量濃度，而且還能間接比較抗菌藥的抑菌效果，以及病原菌對抗菌藥耐藥性產(chǎn)生的速度，更為直觀、可靠[30]。郝貴杰等[31]通過試管二倍稀釋法測定了甲砜霉素、恩諾沙星預混劑等抗菌藥制劑對大黃魚(Pseudosciaenacrocea)致病性哈維氏弧菌(V.harveyi)的體外抑菌活性；樊海平等[32]通過試管二倍稀釋法測定了鹽酸恩諾沙星、米諾沙星、氟苯尼考等抗菌藥對霍亂弧菌、鰻弧菌(V.anguillarum)、嗜水氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌(A.caviae)、溫和氣單胞菌(A.sobria)、遲鈍愛德華氏菌的體外抑菌效果。因此，本試驗選用試管二倍稀釋法測定了硫酸慶大霉素和頭孢噻肟鈉對海藻希瓦菌SFH3的體外抑菌活性。本試驗發(fā)現(xiàn)，相對于甲砜霉素、多西環(huán)素、噁喹酸、磺胺間甲氧嘧啶鈉、磺胺甲噁唑、鹽酸恩諾沙星等漁用抗菌藥，硫酸慶大霉素與頭孢噻肟鈉對海藻希瓦菌SFH3具有良好的抑菌活性，這與張繼挺等[7]研究觀點一致。

3.3 硫酸慶大霉素和頭孢噻肟鈉對海藻希瓦菌體外聯(lián)合抗菌效果分析

迄今為止，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部批準使用的漁藥多為直接由獸藥移用而來[33]。因此，評價獸用抗菌藥對水產(chǎn)致病菌的體外抗菌效果對漁藥的開發(fā)具有重要的意義。硫酸慶大霉素為獸用氨基糖甙類廣譜抗菌藥，通過與細菌核糖蛋白體亞單位上的特異性蛋白牢固結合，干擾核糖蛋白體功能，阻止蛋白質合成，并引起mRNA上密碼的錯誤合成無功能蛋白質，對多種革蘭氏陰性菌及陽性菌均有抑菌和殺菌作用，對蝦紅腿病、爛鰓病、甲殼潰瘍病等細菌性疾病具有潛在的治療效果[11,34]。頭孢噻肟鈉為第三代獸用半合成頭孢菌素，通過與細菌細胞膜上某些酶結合，改變細菌細胞膜的通透性，并釋放自溶素，達到抑菌的效果，因而抗菌譜較第一、二代頭孢菌素更廣[35]。目前，頭孢噻肟鈉與磷霉素鈣聯(lián)用、頭孢噻肟鈉與亞胺培南聯(lián)用的協(xié)同抗菌效果已經(jīng)得到了證實[36-37]，但據(jù)現(xiàn)有文獻資料，硫酸慶大霉素與頭孢噻肟鈉聯(lián)用對水產(chǎn)致病菌的體外聯(lián)合抗菌作用卻鮮有詳細報道。本試驗結果表明，硫酸慶大霉素和頭孢噻肟鈉的聯(lián)用在不同復配比例下能夠顯著增強對海藻希瓦菌SFH3的體外抑菌活性，表現(xiàn)為協(xié)同效應和相加效應，這與文獻[38]研究發(fā)現(xiàn)的兩種殺菌劑在不同復配比例下抗菌效應不同的結論一致。究其原因，可能是硫酸慶大霉素屬于靜止期殺菌劑，能夠迅速抑制海藻希瓦菌SFH3蛋白質的合成，使其處于靜止狀態(tài)，與作為繁殖期殺菌劑的頭孢噻肟鈉聯(lián)用，促進頭孢噻肟鈉充分發(fā)揮其改變細胞膜通透性和釋放自溶素的作用，從而增加了對海藻希瓦菌SFH3的體外抗菌活性，產(chǎn)生了協(xié)同作用和相加作用[34-35,39]。此外，40 mg/L硫酸慶大霉素和80 mg/L頭孢噻肟鈉對海藻希瓦菌SFH3的體外聯(lián)合殺菌作用也具有協(xié)同效果，這可能是因為頭孢噻肟鈉破壞菌體細胞壁的完整性，有利于硫酸慶大霉素進入菌體內與核糖蛋白體亞單位上的特異性蛋白牢固結合，干擾核糖蛋白體功能，最終導致菌體死亡[34,40]。