張達娟，張樹林，戴 偉，孔 欣，王澤斌，畢相東

( 1.天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院，天津 300384； 2.天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384 )

隨著我國水產(chǎn)養(yǎng)殖集約化、高密度養(yǎng)殖模式的日益擴張，打破了池塘原有的生態(tài)平衡，長期養(yǎng)殖方式不當(dāng)造成水體老化，因殘餌、生物排泄物以及動植物尸體的分解，消耗氧氣的同時產(chǎn)生大量有害物質(zhì)，使養(yǎng)殖池塘生態(tài)環(huán)境遭到了嚴重的破壞[1-2]。養(yǎng)殖水體中氮的污染以氨氮和亞硝態(tài)氮的污染最為嚴重，易造成水質(zhì)惡化，養(yǎng)殖生態(tài)遭到嚴重破壞，進而危害養(yǎng)殖動物，導(dǎo)致病害頻發(fā)、水產(chǎn)品質(zhì)量下降。有研究表明，養(yǎng)殖水體中高含量氨氮及亞硝態(tài)氮是魚、蝦發(fā)病的直接或間接因素[3-4]。廣大水產(chǎn)養(yǎng)殖工作者一直致力于養(yǎng)殖水質(zhì)的生物修復(fù)及改善養(yǎng)殖環(huán)境，開發(fā)出了水生植物修復(fù)、浮床植物修復(fù)以及微生物修復(fù)等技術(shù)[5]，其中微生物修復(fù)技術(shù)因具有無污染、無殘留、綠色安全可靠的特點而被廣泛使用[6-9]。

養(yǎng)殖水體中氮循環(huán)需要經(jīng)過氨化作用、亞硝化作用、硝化作用和反硝化作用來完成[5,10]，這一系列反應(yīng)中，微生物起著至關(guān)重要的驅(qū)動作用。研究表明，光合細菌、芽孢桿菌(Bacillus)、硝化細菌、乳酸桿菌(Lactobacillus)等在養(yǎng)殖水體氨氮和亞硝態(tài)氮去除中應(yīng)用十分廣泛，而且也是最為經(jīng)濟生態(tài)環(huán)保的方法。在養(yǎng)殖池塘中投放一定量的光合細菌、硝化細菌等有益菌，能顯著去除水體中氨氮、亞硝態(tài)氮和有機物，增加水中溶解氧，穩(wěn)定水體pH，弧菌(Vibrio)和氣單胞菌(Aeromonas)等致病菌所占比例明顯降低[11-13]。此外，由于益生菌的大量繁殖，在池內(nèi)形成優(yōu)勢種群，提高了水體的微生物多樣性，抑制了病原微生物的繁殖，減少疾病的發(fā)生[14]。根據(jù)水產(chǎn)養(yǎng)殖可持續(xù)發(fā)展的觀點，建立潔凈養(yǎng)殖模式，合理利用復(fù)合微生物制劑有效地控制養(yǎng)殖動物病害的發(fā)生是保持水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康、穩(wěn)定發(fā)展的重要方式。

自第一株好氧反硝化細菌被分離后，國內(nèi)外已有諸多相關(guān)研究，旨在有效去除水體的氨氮和亞硝酸態(tài)氮，改善水產(chǎn)養(yǎng)殖條件。本研究通過對凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)養(yǎng)殖池塘水體和底泥中細菌進行分離、純化、鑒定，并對自然水體的凈化作用的模擬試驗，旨在篩選有益菌，為其應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖、調(diào)節(jié)水質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

在天津?qū)幒訁^(qū)凡納濱對蝦養(yǎng)殖池塘采集泥樣和水樣，帶回實驗室后立即進行分離培養(yǎng)。

1.2 菌種分離及純化

按配方[7]配制異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基。細菌分離方法[15]：取水樣和泥樣懸濁液各1 mL，進行梯度稀釋，得到10-1～10-5的稀釋液，吸取10-3、10-4、10-5不同稀釋倍數(shù)的水樣和泥樣菌懸液各0.1 mL涂布在固體培養(yǎng)基上，30 ℃，恒溫培養(yǎng)2～3 d。再將培養(yǎng)得到的不同形態(tài)特點的細菌分別進行劃線分離，直至得到單一的菌落為止。

1.3 細菌形態(tài)學(xué)鑒定

將分離得到的菌株進行革蘭氏染色，并在顯微鏡下觀察、記錄菌落形態(tài)特點[16-17]。

1.4 16S rDNA序列測定及同源性比較

將分離菌株送往上海生工生物測序公司，測定菌株的16S rDNA序列，將結(jié)果與美國國立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫中的模式菌株16S rDNA基因序列做同源性比較。

1.5 分離細菌對模擬養(yǎng)殖水體的凈化效果測定

取養(yǎng)殖用水，抽濾后，分裝到15個錐形瓶中，每瓶250 mL，向各水樣瓶中分別接入5株分離得到的菌株(每株菌設(shè)3個平行)，每個水樣瓶中菌株的最終密度為2×107cfu/mL。接種后，將水樣置于30 ℃、120 r/min培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，每8 h取50 mL水樣測定水體硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮及氨氮的質(zhì)量濃度，測定方法參照《水和廢水監(jiān)測分析方法》[18]進行。

1.6 數(shù)據(jù)分析

細菌對模擬養(yǎng)殖水體的凈化效果試驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，在統(tǒng)計軟件SPSS 19.0中利用單因素方差分析對數(shù)據(jù)進行分析比較，P<0.05具有顯著差異，P<0.01具有極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離細菌形態(tài)及染色

分離出形態(tài)不同的細菌5株，編號分別為A1、A2、A3、A5、A6，除A6為革蘭氏陽性菌外，其他菌株均為革蘭氏陰性菌。主要形態(tài)學(xué)特點見表1。

表1 菌株的菌落形態(tài)特征Tab.1 The morphological characteristics of strain colonies

2.2 細菌分子生物學(xué)的初步鑒定

各株細菌的16S rDNA序列測定發(fā)現(xiàn)，菌株A1、A2、A3、A5、A6分別與門多薩假單胞菌(Pseudomonasmendocina)、嗜氨甲基桿菌(Methylobacteriumaminovorans)、放射根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)、施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)和氧化微桿菌(Microbacteriumoxydans)的同源性最高，根據(jù)其生物學(xué)分析初步鑒定結(jié)果見表2。

表2 菌株的16S rDNA同源性比較Tab.2 Homological comparison of 16S rDNA sequence in different strains

2.3 不同菌株對養(yǎng)殖水體的凈化能力

分離鑒定出的5株菌對養(yǎng)殖水體的氨氮均有一定的去除作用(圖1、圖2)。培養(yǎng)開始時，水體的氨氮含量約為0.08 mg/L，在8 h時，施氏假單胞菌處理組中氨氮質(zhì)量濃度為0.038 mg/L，降低了0.042 mg/L，顯著低于其他處理組(P<0.05)。隨著培養(yǎng)時間的延長，施氏假單胞菌對氨氮的去除率始終維持在較高水平；接入菌株40 h后，除放射根瘤菌和氧化微桿菌處理組外，其他組中氨氮含量均顯著降低(P<0.05)，門多薩假單胞菌、嗜胺甲基桿菌及施氏假單胞菌對氨氮的去除率均高于80.0%，顯著高于放射根瘤菌和氧化微桿菌(P<0.05)。

圖1 接入菌株后不同時間養(yǎng)殖水體中氨氮含量變化Fig.1 The content of NH4+-N in cultured water after inoculation of bacterial strains in different time

圖2 不同時間各菌株對養(yǎng)殖水體中氨氮的去除率Fig.2 The NH4+-N removal rates of each strain in culture water in different time

分離純化的5株細菌對亞硝態(tài)氮均有一定的去除作用(圖3、圖4)。培養(yǎng)開始時，養(yǎng)殖水體的亞硝態(tài)氮含量約為0.15 mg/L，培養(yǎng)8 h后，接種嗜胺甲基桿菌的自然水體中亞硝態(tài)氮含量最低，為0.051 mg/L，嗜胺甲基桿菌對亞硝態(tài)氮的去除率達84.90%，顯著高于其他菌株(P<0.05)。試驗結(jié)束時，接種的門多薩假單胞菌、嗜胺甲基桿菌和施氏假單胞菌養(yǎng)殖水體中亞硝態(tài)氮含量均顯著低于其他菌種，分別為0.007、0.022 mg/L和0.004 mg/L，3株細菌對亞硝態(tài)氮的去除率分別達95.08%、95.02%和97.39%，顯著高于其他菌株(P<0.05)。

圖3 接入菌株后不同時間養(yǎng)殖水體亞硝態(tài)氮含量變化Fig.3 The content of NO2--N after inoculated strains in culture water in different times

圖4 不同時間各菌株對養(yǎng)殖水體中亞硝態(tài)氮的去除率Fig.4 The NO2--N removal rates of each strain in culture water in different times

養(yǎng)殖水體的硝態(tài)氮含量為0.30 mg/L，培養(yǎng)8 h后，接種門多薩假單胞菌的養(yǎng)殖水體中硝態(tài)氮含量最低，為0.1506 mg/L，門多薩假單胞菌對硝態(tài)氮的去除率達51.03%，顯著高于其他菌株(P<0.05)。培養(yǎng)16 h后，接種放射根瘤菌的自然水體中硝態(tài)氮含量最高，為0.2790 mg/L，對硝態(tài)氮的去除率僅為8.88%，顯著低于其他菌株(P<0.05)。試驗結(jié)束時，接種門多薩假單胞菌和施氏假單胞菌的自然水體中硝態(tài)氮含量顯著低于其他菌種(P<0.05)，分別為0.0283 mg/L和0.0274 mg/L，兩株細菌對氨氮的去除率分別為90.49%和91.22%，顯著高于其他菌株(P<0.05)(圖5、圖6)。

圖5 接入菌株后不同時間養(yǎng)殖水體硝態(tài)氮含量變化Fig.5 The content of NO3--N after inoculated strains in culture water in different times

圖6 不同時間各菌種對水樣中硝態(tài)氮的去除率Fig.6 The NO3--N removal rates of each strain in culture water in different time

3 討 論

3.1 假單胞菌對水質(zhì)的凈化作用

生物脫氮指微生物在適宜條件下，將水體中的有機氮和無機氮轉(zhuǎn)化為氣態(tài)氮，從而排出水體的過程[5]，以此為基礎(chǔ)衍生的生物脫氮技術(shù)因其無污染、綠色安全、脫氮徹底等優(yōu)點而被認為是最經(jīng)濟有效、可行的水體除氮方法[19]。迄今已有利用地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)[20]、硝化細菌[21]、反硝化細菌[22]、不動桿菌(Acinetobacter)[23]、假單胞菌(Pseudomonas)[8,24]等細菌進行生物脫氮的報道，但在其產(chǎn)物和脫氮能力上存在差異。

本試驗的門多薩假單胞菌和施氏假單胞菌均為重要脫氮細菌，也是重要的反硝化細菌[25]。傳統(tǒng)的生物脫氮理論認為，反硝化在有氧的條件下不能進行，氧氣的存在阻止了亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮接受電子，后有研究發(fā)現(xiàn)亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮和氧氣均可作為電子受體進行反硝化作用[26]，而施氏假單胞菌就能在極高的氧氣條件下進行反硝化作用[27]。池塘水體和底泥是反硝化細菌存在和生長的重要場所，其種類和數(shù)量直接影響著池塘的氮循環(huán)。林娜等[28]在池塘水體和底泥中分別篩選出6株和8株好氧反硝化細菌，且以假單胞菌為主，其中一株菌Ochrobactrumsp.在2 d內(nèi)的脫氮率超過80%。楊俊忠等[29]利用富集分離的方法，在魚池中分離到假單胞菌HSN-62等22株反硝化細菌，且假單胞菌在12 h內(nèi)對硝酸鹽的去除率高達96%。本試驗中，門多薩假單胞菌和施氏假單胞菌在16 h內(nèi)對硝酸鹽的去除率分別為68.15%和51.20%，顯著高于其他菌株(P<0.05)，而16 h對于亞硝態(tài)氮的去除率分別為53.36%和56.29%，亦顯著高于其他菌株(P<0.05)，但低于楊俊忠等[29]的試驗結(jié)果，這可能是菌株之間的差異性所致。施氏假單胞菌可顯著降低亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮含量，是因為它能將二者作為唯一氮源進行脫氮，尤其是亞硝態(tài)氮的存在可以顯著促進施氏假單胞菌的nirS和nosZ基因表達，而這兩個基因是控制假單胞菌亞硝態(tài)氮還原酶以及一氧化二氮還原酶的重要基因[26]。

3.2 分離的其他菌株在水質(zhì)凈化中的作用

氧化微桿菌為嗜堿性微生物，可在pH 5～12內(nèi)生長[30]，常用于降解污染物[31]和生物脫硫[32]等。王亞南等[33]在海水養(yǎng)蝦場底泥中分離出微桿菌屬細菌，本試驗也分離出一株氧化微桿菌，表明這類細菌能夠在養(yǎng)蝦池底泥中分布。對蝦投放的餌料成分中含有有機硫化合物和硫酸鹽，殘餌及生物排泄物等沉積在池塘底部，造成硫化物的積累，氧化微桿菌可以利用硫化物代謝產(chǎn)生H2S，但對氮素利用率卻較低，這類細菌雖然在養(yǎng)殖池塘菌群中所占比例較少，但具有較強的適應(yīng)性和穩(wěn)定性。此外，本試驗分離出1株放射根瘤菌，屬于根瘤菌屬種類，是生活在土壤中的革蘭氏陰性菌，具有生物固氮作用[34]，對鹽漬[35]、重金屬[36]、多氯聯(lián)苯和多環(huán)芳烴[37]等污染土壤有修復(fù)作用，但對氮素的清除作用較小。嗜胺甲基桿菌通常分離于污泥、河水中，它可以實現(xiàn)工業(yè)化處理甲醇或重污染廢水，使廢水達到排放指標(biāo)[38]。馬立周等[39]在甲醇污染的土壤中分離純化到該細菌，并對其培養(yǎng)條件進行初步優(yōu)化。本研究首次在養(yǎng)殖池塘中分離出該菌株。

在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，以復(fù)合有益菌為代表的微生態(tài)制劑是從天然環(huán)境中篩選分離出的菌種，經(jīng)過培養(yǎng)后制成的活菌菌劑。本試驗中分離的假單胞菌、氧化微桿菌是常用的微生態(tài)制劑種類。從微生態(tài)平衡看，有益微生物和病原菌之間存在對營養(yǎng)、能量和空間的爭奪，可在一定程度上抑制病原菌；有益菌可通過自身分泌的代謝物質(zhì)調(diào)整微生態(tài)平衡；同時還具有改善水質(zhì)、提高機體免疫力的作用。相對其他抗病途徑而言，微生態(tài)制劑因具有綠色、環(huán)保、安全等特點，仍是抗生素最有潛力的替代品，但由于一些菌體穩(wěn)定性差、活性難維持、對突發(fā)病作用甚微、使用技術(shù)較難掌握等弱點，微生態(tài)制劑組成菌株和組合方式仍需進一步研究。

通過對凡納濱對蝦養(yǎng)殖池塘水質(zhì)和底泥中細菌進行分離純化后得到5株菌，分別為門多薩假單胞菌、嗜胺甲基桿菌、放射根瘤菌、施氏假單胞菌和氧化微桿菌。門多薩假單胞菌和施氏假單胞菌對氨氮的去除率分別為88.83%和91.73%；對亞硝態(tài)氮的去除率分別為95.08%和97.39%；對硝態(tài)氮的去除率分別為90.49%和91.22%，表現(xiàn)出較好的去除效果，在凈化養(yǎng)殖水體水質(zhì)中有顯著效果，可作為潛在的益生菌株進一步考察應(yīng)用。