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        重癥醫(yī)學科血流感染耐碳青霉烯類高黏液型肺炎克雷伯菌的臨床及分子特征

        2020-03-19 06:10:08杜芳玲魏丹丹梅艷芳萬臘根
        中國感染與化療雜志 2020年2期
        關(guān)鍵詞:烯類克雷伯青霉

        杜芳玲, 魏丹丹, 梅艷芳, 龍 丹, 萬臘根, 劉 洋

        20世紀80年代中期,我國臺灣學者首次報道了一種具有高黏液表型的肺炎克雷伯菌,被稱為高黏液型肺炎克雷伯菌(HMKP),其常引起侵襲性感染,且易導致轉(zhuǎn)移性感染[1]。隨著碳青霉烯類抗生素的廣泛使用以及編碼碳青霉烯酶的移動遺傳元件的傳播,耐碳青霉烯類(CR)-HMKP逐漸在全球范圍內(nèi)被發(fā)現(xiàn)[2-3]。CR-HMKP的出現(xiàn)對公眾健康構(gòu)成了嚴重威脅,因其可能在健康個體中引起嚴重的、無法治愈的感染[3]。本研究分析醫(yī)院重癥醫(yī)學科(ICU)CR-HMKP血流感染患者的臨床及分子特征,為臨床預(yù)防及控制CR-HMKP感染提供依據(jù)?,F(xiàn)報道如下。

        1 材料與方法

        1.1 菌株來源及鑒定

        2016年1月-2018年12月從南昌大學第一附屬醫(yī)院ICU血流感染患者中分離40株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(CR-KP),采用VITEK 2-Compact全自動細菌鑒定儀進行生化鑒定并保存。血流感染患者納入標準:血液標本培養(yǎng)分離出肺炎克雷伯菌,體溫>38 ℃或<36 ℃,可伴有寒戰(zhàn),并合并下列情況之一,即①有入侵門戶或遷徙病灶;②有全身中毒癥狀而無明顯感染灶;③有皮疹或出血點、肝脾腫大、外周血中性粒細胞增多伴核左移,且無其他原因可以解釋;④收縮壓低于12 kPa(90 mmHg)或較原收縮壓下降超過5.3 kPa(40 mmHg)[4]。

        1.2 高黏液表型檢測

        用拉絲試驗檢測[5],使用接種環(huán)從哥倫比亞血瓊脂平皿上挑起過夜培養(yǎng)的受試肺炎克雷伯菌菌落,重復(fù)牽拉兩次,若兩次長度均大于5 mm即判為黏液絲試驗陽性。

        1.3 藥敏試驗和耐藥基因檢測

        用VITEK 2-Compact全自動微生物分析儀進行體外藥物敏感性試驗(藥敏卡GN13),參照美國臨床和實驗室標準化協(xié)會(CLSI)標準中對敏感、中介、耐藥的解釋。用改良碳青霉烯滅活試驗(mCIM)方法初步篩查碳青霉烯酶[6]。熱裂解法提取菌株DNA。參照文獻 [7],PCR擴增檢測14種耐藥基因,其中4種碳青霉烯酶基因(KPC、NDM、OXA-48、VIM)、2種16S rRNA甲基化酶基因(rmtB、armA)、3種β內(nèi) 酰 胺 酶 基 因(blaCTX-M-14、blaSHV、blaTEM)和4種PMQR基因[qnrA、qnrB、qnrS、acc(6’)-Ib-cr]。

        1.4 莢膜血清分型及毒力基因檢測

        參照文獻 [8-9],用PCR方法篩選高毒力莢膜血清型(K1、K2、K5、K20、K54、K57),擴增10種常見毒力基因(rmpA、iutA、rmpA2、magA、allS、wcaG、aerobactin、ybtS、entB、kfu)。

        1.5 脈沖場凝膠電泳(PFGE)

        將菌液與低熔點膠混勻后灌模,蛋白酶K消化3 h,TE緩沖液和水清洗后,使用XbaⅠ內(nèi)切酶(TaKaRa公司)消化4 h。配制1%的瓊脂糖凝膠,在CHEF-DR Ⅲ(美國Bio-Rad公司)上進行PFGE,相似性>80%的菌株被定義為相同的PFGE型[9]。

        1.6 多位點序列分型(MLST)

        P C R 擴增肺炎克雷伯菌的7 個管家基因(gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB、tonB)并進行測序,再與數(shù)據(jù)庫比對(http://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html),分析菌株的序列型[8]。

        2 結(jié)果

        2.1 臨床特點

        40例CR-KP血流感染患者以男性為主,年齡以≥60歲為主,侵襲性操作以氣管插管占首位,均接受兩種或兩種以上侵襲性操作,均聯(lián)合使用多種抗生素。CR-HMKP菌株感染患者60歲以上的占比、糖尿病患病率、死亡率比CR-非HMKP菌株感染患者高,且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

        表1 40 例CR-KP 血流感染患者臨床特點Table 1 Clinical characteristics of 40 carbapenem-resistant K. pneumoniae strains isolated from bloodstream infections in ICU patients

        2.2 藥敏結(jié)果

        ICU血流感染患者分離的40株CR-KP均為多重耐藥(MDR)菌,對臨床使用的3類或3類以上抗菌藥物同時呈現(xiàn)耐藥,對碳青霉烯類和β內(nèi)酰胺類藥物耐藥率達100%。CR-HMKP菌株對慶大霉素、妥布霉素、阿米卡星的耐藥率比CR-非HMKP菌株低,且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);除這3種抗菌藥物外,其他抗菌藥物對CR-HMKP菌株和CR-非HMKP菌株抗菌活性基本相同,差異無統(tǒng)計學意義。見表2。

        表2 40 株CR-KP 菌株對抗菌藥物的耐藥率比較Table 2 Resistance profile of 40 carbapenem-resistant K. pneumoniae strains isolated from bloodstream infections in ICU patients

        2.3 耐藥基因檢測

        40株CR-KP菌株mCIM結(jié)果陽性,14株CRHMKP菌株均攜帶KPC基因,26株CR-非HMKP中24株攜帶KPC基因,2株攜帶NDM基因。rmtB基因在CR-HMKP菌株的檢出率小于CR-非HMKP菌株,且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),其他耐藥基因在CR-HMKP菌株與CR-非HMKP菌株中分布一致,差異無統(tǒng)計學意義;未檢出VIM、OXA- 48、armA、qnrA基因。見表3。

        2.4 血清莢膜分型及毒力基因分布

        CR-HMKP菌株中僅檢出1株K2型菌株,其余CR-KP菌株的血清莢膜分型均未獲分型。ICU血流感染CR-KP以ybtS基因和entB基因的流行最為廣泛,陽性率分別為100%和82.5%。3種毒力基因rmpA、iutA、rmpA2在CR-HMKP菌株中的檢出率均大于CR-非HMKP菌株,且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),其余7種毒力基因在CR-HMKP菌株與CR-非HMKP菌株中分布一致,差異無統(tǒng)計學意義。見表4。

        表3 40 株CR-KP 的耐藥基因分布Table 3 Prevalence of resistance genes among 40 carbapenem-resistant K. pneumoniae strains

        表4 40 株CR-KP 的毒力基因分布Table 4 Distribution of virulence genes among 40 carbapenem-resistant K. pneumoniae strains

        2.5 菌株同源性分析

        PFGE和MLST分析顯示CR-HMKP分為A和B型,A型(n=13,92.9%)均為ST11型,B型(n=1,7.1%)為ST65型。見圖1。

        圖1 14 株CR-HMKP 的PFGE 和MLST 結(jié)果Figure 1 Pulsed field gel electrophoresis and multilocus sequence typing results for 14 strains of carbapenem-resistant hypermucoviscous K. pneumoniae isolated from bloodstream infections in ICU patients

        3 討論

        CR-HMKP因其高毒力和獲得性碳青霉烯類耐藥性,已成為近年來最具挑戰(zhàn)性的病原體之一。本研究中ICU血流感染患者中CR-HMKP在CR-KP中的檢出率為35.0%,比Zhan等[3]報道的檢出率(15%)高。血流感染中HMKP高檢出率(45.9%)可能導致CR-HMKP的高檢出率[10]。

        臨床資料顯示大部分患者感染診斷前已聯(lián)合使用抗生素治療、入住ICU以及使用侵襲性操作,上述措施是CR-KP感染的重要危險因素[11]。CRHMKP菌株感染患者糖尿病患病率(42.9%)比CR-非HMKP菌株感染患者(7.7%)高,且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。糖尿病被認為是高毒力肺炎克雷伯菌感染的重要危險因素[12]。ICU中CR-KP血流感染患者的死亡率高(70.0%),且CR-HMKP菌株感染患者死亡率(92.9%)比CR-非HMKP菌株感染患者(57.7%)高,差異有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。在ICU,因患者病情危重,免疫功能低下,并且還需要定期進行侵襲性的檢查,容易發(fā)生血流感染,治療困難且死亡率較高[13]。

        藥敏資料顯示CR-KP菌株均為MDR菌,對大部分藥物耐藥率高。CR-HMKP菌株對慶大霉素、妥布霉素、阿米卡星的耐藥率比CR-非HMKP菌株低,且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),表明臨床上慶大霉素、阿米卡星、妥布霉素對CR-HMKP感染患者可能是有價值的治療選擇。碳青霉烯酶(如KPC)的產(chǎn)生是肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類耐藥的最普遍機制[14]。本研究中所有CR-HMKP分離株均為KPC基因陽性,與之前發(fā)現(xiàn)的HMKP耐碳青霉烯類的原因相同[15]。

        毒力基因檢測顯示rmpA、iutA、rmpA2基因在CR-HMKP菌株的檢出率均大于CR-非HMKP菌株,且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。rmpA和rmpA2基因參與菌株黏液性狀的調(diào)控。iutA基因是編碼產(chǎn)氣毒素受體,該鐵攝取途徑可能與肺炎克雷伯菌的高毒力相關(guān),受體增加是CR-HMKP菌株鐵攝取能力提升的關(guān)鍵[16]。

        Zhang等[17]報道在5株CR-HMKP分離株中,只有1株屬于K2型,其余4株未分型,未分型中3株為ST11型。同樣,本研究只發(fā)現(xiàn)1株CR-HMKP分離株屬于K2型(1/14,7.1%),其余13株未分型,均為ST11型。相反,Yao等[18]報道7株耐碳青霉烯類CR-HMKP分離株中6株屬于K2型。另外,Zhan等[3]發(fā)現(xiàn)了ST20型CR-HMKP。本研究中1株K2型菌株屬于ST65型,這與先前的研究一致,ST65是K2血清型肺炎克雷伯菌中最常見的ST型[19]。

        綜上所述,本研究闡述了CR-HMKP菌株以ST11為主,均為MDR,攜帶多種耐藥基因與毒力基因,且死亡率高。應(yīng)加強對ICU的監(jiān)測,重視血流感染的診治與傳播防控,提高醫(yī)護人員對CRHMKP的認識,減少醫(yī)院感染的發(fā)生。CR-HMKP與CR-非HMKP對氨基糖苷類抗生素的耐藥情況有差別,臨床在治療過程中應(yīng)區(qū)別對待。

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