廖文建， 祝蘭蘭， 杜芳玲， 龍 丹， 張 偉， 劉 洋

肺炎克雷伯菌是臨床上僅次于大腸埃希菌最常見(jiàn)的機(jī)會(huì)致病菌，近年來(lái)世界各地報(bào)道均呈現(xiàn)高毒力、高耐藥等特點(diǎn)，對(duì)醫(yī)院感染的控制提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)[1]。1980年國(guó)外學(xué)者提出細(xì)菌的獲得性免疫系統(tǒng)CRISPR-Cas系統(tǒng)，主要由成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats， CRISPR ）及其相關(guān)序列（CRISPR associated sequences， Cas）組成[2]。在肺炎克雷伯菌中根據(jù)其Cas基因的構(gòu)架主要分為I-E*型和I-E型CRISPR-Cas系統(tǒng)[3]。研究表明CRISPR-Cas系統(tǒng)參與干擾細(xì)菌毒力及獲得性耐藥，但具體機(jī)制不明確[4-5]。本研究探究高毒力肺炎克雷伯菌（hvKP）中CRISPR-Cas系統(tǒng)的分布及與毒力和耐藥的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源及鑒定

收集南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院2017年1月－2018年12月268株非重復(fù)肺炎克雷伯菌，采用VITEK 2-Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀進(jìn)行生化鑒定并保存。鑒于目前鑒定hvKP的方法尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，本研究定義hvKP為：①血清莢膜分型K1/K2菌株；②毒力基因rmpA/rmpA2陽(yáng)性菌株[6]。

1.2 CRISPR-Cas系統(tǒng)檢測(cè)

熱裂解法提取粗制菌株DNA。參考Li等[4]、Lin等[7]文獻(xiàn)，PCR擴(kuò)增檢測(cè)Cas1、Cas3、CRISPR1和CRISPR24個(gè)基因，PCR擴(kuò)增的引物序列、退火溫度參照相關(guān)操作進(jìn)行。確定CRISPRCas系統(tǒng)的存在及類型（I-E*和I-E）。

1.3 藥敏試驗(yàn)和耐藥基因檢測(cè)

體外藥物敏感性試驗(yàn)用VITEK 2-Compact全自動(dòng)微生物分析儀開(kāi)展，參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)耐藥（R）、敏感（S）的解釋。PCR擴(kuò)增檢測(cè)14種耐藥基因，其中5種碳青霉烯酶基因（blaKPC-2、blaOXA-48、blaVIM、blaIMP和blaNDM-1），3種β內(nèi)酰胺酶基因（SHV、TEM和CTX-M-14），2種16S rRNA甲基化酶基因（amrA和rmtB），4種PMQR基因[qnrA、qnrB、qnrS和acc(6’)-Ib-cr]。PCR的擴(kuò)增引物、條件和體系參照文獻(xiàn) [8]。

1.4 莢膜血清分型基因K1/K2和毒力基因檢測(cè)

對(duì)所有肺炎克雷伯菌PCR篩選高毒力莢膜血清型基因K1/K2，并用PCR方法對(duì)其擴(kuò)增14種常見(jiàn)毒力基因（magA、rmpA、terW、silS、iutA、rmpA2、kfuBC、wcaG、allS、kpn、entB、ytbS、repA、aerobactin）。PCR的擴(kuò)增引物、條件和體系參照文獻(xiàn) [9-10]。

1.5 大蠟螟毒力實(shí)驗(yàn)

將所有培養(yǎng)在MH肉湯處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺炎克雷伯菌通過(guò)離心懸浮法制成1.0×1011CFU/ L。設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)菌株肺炎克雷伯菌ATCC 700603和NUTHK2044為毒力對(duì)照組，將配制的菌液用微量注射器經(jīng)右后足注射10 μL入大蠟螟幼蟲(chóng)體腔，每株臨床分離菌株菌液分別注入10條隨機(jī)分配的幼蟲(chóng)。將所有大蠟螟置于一次性培養(yǎng)皿中37 ℃培養(yǎng)箱中孵育120 h，注射后記錄24 h、48 h、72 h、96 h、120 h大蠟螟的存活情況，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，最后統(tǒng)計(jì)每組大蠟螟平均半數(shù)生存時(shí)間（即每一次實(shí)驗(yàn)當(dāng)10條大蠟螟存活剩余約5條的時(shí)候記錄下觀察時(shí)間，3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到的半數(shù)生存時(shí)間取平均數(shù)）[11]。

1.6 細(xì)菌分子流行病學(xué)檢測(cè)

采用多位點(diǎn)序列分型（MLST）對(duì)所有hvKP進(jìn)行同源性分析。7個(gè)管家基因片段：rpoB、gapA、mdh、pgi、phoE、infB和tonB通過(guò)PCR擴(kuò)增后直接測(cè)序，結(jié)果與網(wǎng)站（http：//www.Pasteur.fr/ recherch/ genopole/ PF8/ mlst/ primers_Kpneumoniae.html）已建立的標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行比對(duì)[12]。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，根據(jù)攜帶CRISPR-Cas系統(tǒng)類型與否進(jìn)行分組，對(duì)其莢膜血清分型、毒力基因、抗菌藥物的耐藥性、耐藥基因進(jìn)行比較。由于均為計(jì)量資料使用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析，采用GraphPad Prism 5.0軟件繪制Kaplan-Meier存活曲線，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者臨床資料和菌株CRISPR-Cas系統(tǒng)分布

依據(jù)本研究hvKP診斷標(biāo)準(zhǔn)，從268株肺炎克雷伯菌篩選出61株hvKP，標(biāo)本來(lái)源于61例患者，分離自血液34株、痰液14株、肝膿腫膿液9株、燒傷傷口分泌物1株、氣道分泌物1株、中段尿液1 株、胸水1株。61株hvKP中攜帶CRISPR-Cas系統(tǒng)21株，陽(yáng)性率為34.4%，均為I-E*型CRISPR-Cas系統(tǒng)，未檢測(cè)到I-E型CRISPR-Cas系統(tǒng)；根據(jù)細(xì)菌CRISPR-Cas系統(tǒng)有無(wú)，所有hvKP分為CRISPR-Cas系統(tǒng)陽(yáng)性組和CRISPR-Cas系統(tǒng)陰性組。通過(guò)比較兩組細(xì)菌感染患者的臨床資料顯示，兩組患者年齡、性別、基礎(chǔ)疾病、ICU入住率、侵襲性操作及碳青霉烯類抗生素應(yīng)用均未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但兩組間30 d病死率差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（5/21對(duì)22/40，P=0.02）。此外藥敏試驗(yàn)顯示，CRISPRCas系統(tǒng)陰性組對(duì)12種抗菌藥物耐藥率明顯高于CRISPR-Cas系統(tǒng)陽(yáng)性組（P＜0.05），抗菌藥物包括碳青霉烯類亞胺培南，β內(nèi)酰胺類頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢唑林、氨芐西林-舒巴坦、哌拉西林-他唑巴坦、氨曲南，喹諾酮類左氧氟沙星，氨基糖苷類妥布霉素、慶大霉素，甲氧芐啶-磺胺甲唑。所有hvKP對(duì)慶大霉素耐藥率最低（21/61，34.4%）。見(jiàn)表1。

表1 患者臨床資料、藥敏結(jié)果與菌株CRISPR-Cas 系統(tǒng)分布Table 1 Clinical characteristics of patients and antibiotic susceptibility of hypervirulent K. pneumoniae isolates with or without CRISPR-Cas system

2.2 耐藥基因分布與CRISPR-Cas系統(tǒng)分布的關(guān)系

61株hvKP中均未檢測(cè)到VIM、IMP、OXA-48、qnrA，除blaNDM-1、qnrB差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，CRISPR-Cas系統(tǒng)陽(yáng)性組菌耐藥基因blaKPC-2、blaSHV、blaTEM、blaCTX-M-14、rmtB、armA、qnrS、acc(6’)-Ib-cr陽(yáng)性率均小于CRISPR-Cas系統(tǒng)陰性組菌，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表 2。

2.3 莢膜血清分型、毒力基因與CRISPR-Cas系統(tǒng)分布的關(guān)系

所有CRISPR-Cas系統(tǒng)陽(yáng)性組血清莢膜分型均為K1型，未檢測(cè)到K2型；CRISPR-Cas系統(tǒng)陰性組檢測(cè)到K1型血清莢膜分型2株，K2型5株。PCR擴(kuò)增毒力基因顯示，所有hvKP均攜帶entB毒力基因，除毒力基因kpn、repA外，CRISPR-Cas系統(tǒng)陽(yáng)性組攜帶毒力基因陽(yáng)性率均大于CRISPRCas系統(tǒng)陰性組，其中毒力基因magA、kfuBC、wcaG、allS、aerobactin差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表3。

表2 耐藥基因與菌株CRISPR-Cas 系統(tǒng)分布Table 2 The association between antibiotic resistance genes and CRISPR-Cas systems in hypervirulent K. pneumoniae isolates

表3 莢膜血清分型、毒力基因與菌株CRISPR-Cas 系統(tǒng)分布Table 3 The association between capsular serotypes， virulence genes and CRISPR-Cas systems in hypervirulent K. pneumoniae isolates

2.4 細(xì)菌毒力、MLST與CRISPR-Cas系統(tǒng)分布的關(guān)系

記錄所有hvKP感染大蠟螟半數(shù)生存時(shí)間，生存曲線分析顯示，CRISPR-Cas系統(tǒng)陽(yáng)性組大蠟螟平均半數(shù)生存時(shí)間（h）少于CRISPR-Cas系統(tǒng)陰性組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。MLST結(jié)果顯示，21株攜帶I-E*型CRISPR-Cas系統(tǒng)的hvKP均為ST23型，而40株不攜帶CRISPR-Cas系統(tǒng)的hvKP ST11型31株，ST65型4株，ST86型2株，ST23型2株，ST1764型1株。見(jiàn)表4。

表4 細(xì)菌毒力、多位點(diǎn)序列分型與CRISPR-Cas 系統(tǒng)分布Table 4 Multilocus sequence typing （MLST） types and average survival time of the Galleria mellonella larvae after infection with hypervirulent K. pneumoniae isolates

3 討論

目前認(rèn)為CRISPR-Cas系統(tǒng)為細(xì)菌與古細(xì)菌中抵御外源病毒及質(zhì)粒DNA入侵的獲得性免疫機(jī)制系統(tǒng)[13]。本研究分析臨床hvKP CRISPR-Cas系統(tǒng)的分布，并嘗試探究該系統(tǒng)對(duì)hvKP毒力及耐藥的影 響。

本研究61株hvKP中CRISPR-Cas系統(tǒng)檢出率為34.4%，高于Li等[4]30.7%和Lin等[7]12.4%的報(bào)道，且本研究中攜帶I-E*型CRISPR-Cas系統(tǒng)hvKP均為ST23型K1菌株，考慮CRISPR-Cas系統(tǒng)在某些菌株高度集中。毒力基因檢測(cè)結(jié)果顯示，CRISPR-Cas系統(tǒng)陽(yáng)性組菌攜帶毒力基因陽(yáng)性率大于CRISPRCas系統(tǒng)陰性組菌，其中毒力基因magA、kfuBC、wcaG、allS、aerobactin差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；大蠟螟毒力實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CRISPR-Cas系統(tǒng)陽(yáng)性組菌毒力明顯強(qiáng)于CRISPR-Cas系統(tǒng)陰性組菌，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CRISPRCas系統(tǒng)與hvKP毒力相對(duì)強(qiáng)弱密切相關(guān)，考慮可能I-E*型CRISPR-Cas系統(tǒng)與部分超hvKP克隆株緊密相關(guān)[14]。但毒力質(zhì)粒pLVPK相關(guān)的毒力基因（terW、iutA、rmpA、silS和rmpA2），兩組間未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，CRISPR-Cas系統(tǒng)對(duì)毒力質(zhì)粒未表現(xiàn)出剪輯作用，考慮原因可能是毒力質(zhì)粒為部分超高毒力菌株所固有，并非外源性獲得，機(jī)制需要進(jìn)一步闡明。

61株hvKP藥敏資料和耐藥基因檢測(cè)結(jié)果顯示，CRISPR-Cas系統(tǒng)陰性組菌對(duì)各類抗菌藥物耐藥率均明顯高于CRISPR-Cas系統(tǒng)陽(yáng)性組，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與Li等[4]報(bào)道相符。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在hvKP中，CRISPR-Cas系統(tǒng)有效地限制了耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移從而保持了細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的敏感性[15]。然而，對(duì)于耐藥基因blaNDM-1，兩組間未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而且在CRISPR-Cas系統(tǒng)陽(yáng)性hvKP株中也可以檢測(cè)到數(shù)個(gè)散在耐藥基因，原因考慮有三：一是部分菌株中存在對(duì)抗CRISPR-Cas系統(tǒng)蛋白限制CRISPR-Cas系統(tǒng)功能發(fā)揮，二是部分菌株由于自身靶向間隔序列的存在導(dǎo)致CRISPRCas系統(tǒng)功能未活化，三是由于臨床上碳青霉烯類藥物濫用，而碳青霉烯類藥物可以通過(guò)HNS調(diào)控壓制CRISPR-Cas系統(tǒng)功能[7，16-17]。

本研究中MLST結(jié)果表明，hvKP CRISPR-Cas系統(tǒng)分布與MLST型別密切相關(guān)，所有攜帶I-E*型CRISPR-Cas系統(tǒng)均為ST23型，其他ST分型暫未檢測(cè)到CRISPR-Cas系統(tǒng)的存在，MLST在一定程度上可以預(yù)測(cè)CRISPR-Cas系統(tǒng)的存在，這與Li等[4]報(bào)道相符。

61株hvKP中有39株為碳青霉烯類耐藥hvKP（CR-hvKP），表明hvKP耐藥也在愈益升高，其中CRISPR-Cas系統(tǒng)陽(yáng)性只有5株，而CRISPR-Cas系統(tǒng)陰性有34株，其中ST11型31株，ST65 K2型2株，ST86 K2型1株，表明小部分“CR-hvKP”菌株來(lái)源于hvKP菌株獲得耐藥質(zhì)粒，而大部分“CR-hvKP”菌株來(lái)源于CRKP菌株獲得毒力質(zhì)粒，這與Wyres等[14]報(bào)道“CR-hvKP”菌株進(jìn)化來(lái)源相符。這也是導(dǎo)致本研究中感染“大部分”CRISPR-Cas系統(tǒng)陰性高毒力菌株患者30 d內(nèi)病死率明顯高于感染“小部分”CRISPR-Cas系統(tǒng)陽(yáng)性菌株的主要原因，雖然CRISPR-Cas系統(tǒng)陽(yáng)性hvKP平均毒力高于CRISPR-Cas系統(tǒng)陰性高毒力菌株，但CRISPR-Cas系統(tǒng)限制耐藥質(zhì)粒的獲得，因此大部分CRISPR-Cas系統(tǒng)陽(yáng)性菌株仍屬于抗生素敏感菌株，經(jīng)過(guò)臨床及時(shí)抗感染治療后仍有痊愈的希望，所以臨床上更應(yīng)該警惕世界流行的ST11型肺炎克雷伯菌，由于缺乏CRISPR-Cas系統(tǒng)對(duì)耐藥基因的限制，非常容易形成泛耐藥，一旦此類菌株進(jìn)化獲得毒力質(zhì)粒pLVPK即可成為“CRhvKP”，對(duì)臨床感染治療與控制將是艱難挑戰(zhàn)，或許CRISPR-Cas系統(tǒng)聯(lián)合抗生素可以成為此類超級(jí)細(xì)菌有效殺菌制 劑。