孫田歌，孟凡華，楊敏，趙紅梅，于志艷，張瑞，臧淑妃

復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院，上海200240

妊娠期糖尿病(GDM)是一種慢性低度炎癥性疾病。多項(xiàng)研究顯示，GDM患者IL-6、IL-8、IL-18、TNF-α、CRP等促炎因子水平升高，炎癥狀態(tài)的激活導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生，胰島素抵抗是妊娠期糖尿病患者的顯著特征。中性粒細(xì)胞是第一個(gè)對(duì)炎癥作出反應(yīng)的免疫細(xì)胞[1～3]，近年研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞可以促發(fā)機(jī)體發(fā)生慢性低度炎癥狀態(tài)[4, 5]。中性粒細(xì)胞分泌一種促炎性蛋白酶，稱為中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(NE)。而絲氨酸蛋白酶抑制劑α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)是一種NE的內(nèi)源性抑制劑。研究發(fā)現(xiàn)，黃連素可以顯著改善2型糖尿病、肥胖、多囊卵巢綜合征等患者的代謝紊亂。但其在GDM中的作用少有研究。2018年5月～2019年8月，我們通過(guò)高脂喂養(yǎng)及間斷小劑量鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的方法建立了GDM大鼠模型，探討黃連素對(duì)GDM大鼠肝臟組織NE的影響及其對(duì)胰島素抵抗的改善作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑 SPF級(jí)6周齡清潔級(jí)雌性SD大鼠30只，10周齡雄性大鼠15只，體質(zhì)量340～380 g，購(gòu)自南京動(dòng)物模式研究所，許可證號(hào)：SCXK(蘇)2010-0001。STZ購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；高脂高膽固醇飼料(20%蛋白質(zhì)、50%碳水化合物、21%脂肪和0.21%膽固醇)購(gòu)自New Brunswick公司；黃連素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；免疫組化一抗(抗NE兔多克隆抗體)購(gòu)自英國(guó)Biorbyt公司；免疫組化二抗(山羊抗兔IgG)購(gòu)自麥約爾生物公司(HSA0003)；ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司；TRIzol購(gòu)自Ambion公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green試劑盒購(gòu)自Invitrigen公司；Western一抗稀釋液和二抗稀釋液購(gòu)自碧云天公司(P0023A)。

1.2 動(dòng)物分組及GDM模型構(gòu)建 30只雌性大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為對(duì)照組10只、GDM組8只、黃連素干預(yù)組8只。對(duì)照組用普通飼料和普通飲用水喂養(yǎng)4周，GDM組和黃連素干預(yù)組用高脂飼料喂養(yǎng)4周。4周后，將各組大鼠按雌雄比2∶1的比例合籠交配，第2天檢栓及陰道涂片檢查，確定為妊娠第0天(D0)。確認(rèn)妊娠大鼠后，模型組大鼠在D0時(shí)腹膜內(nèi)注射20 mg/kg STZ(0.1 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液pH 4.5配制)構(gòu)建GDM模型。STZ誘導(dǎo)72 h后檢測(cè)血糖水平，連續(xù)檢測(cè)3次，以血糖>16.7 mmol/L確定為GDM大鼠，并再次予以腹腔內(nèi)注射10 mg/kg STZ。對(duì)照組分別在D0和D3時(shí)腹腔內(nèi)注射同等容量的生理鹽水。造模后繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)。

1.3 干預(yù)方法 造模后，黃連素干預(yù)組予以黃連素100 mg/kg，分3次每日灌喂，共15 d。對(duì)照組、GDM組予以相同方法使用同等容量生理鹽水灌喂。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1 血糖及胰島素抵抗指數(shù)(IR) 分別于大鼠妊娠D0、D4、D8、D12、D16和D19時(shí)予以剪尾，使用羅氏血糖儀檢測(cè)監(jiān)測(cè)血糖，直至大鼠分娩。于D0、D8、D16和D19時(shí)空腹采血，采用電化學(xué)發(fā)光法(羅氏 cobas e602，瑞士)檢測(cè)大鼠胰島素水平，應(yīng)用穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估法計(jì)算IR=空腹血糖×空腹胰島素/22.5。

1.4.2 血脂、肝功能指標(biāo) 各組大鼠分別于D0和D19時(shí)禁食12 h，尾靜脈斷尾采血，分離血清，-20 ℃保存，采用全自動(dòng)生化分析儀(Sysmex XN9000，日本)測(cè)定血總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)。

1.4.3 體質(zhì)量、胎鼠體質(zhì)量及胎盤體質(zhì)量 于D0和D19稱取大鼠體質(zhì)量。各組大鼠于D19時(shí)，水合氯醛麻醉，剖腹切除子宮兩側(cè)子宮角，從子宮中取出胎鼠、胎盤并稱重。

1.4.4 肝臟組織NE蛋白表達(dá) ①免疫組化法：由肝左葉固定部位取材，一塊3 mm × 3 mm放入4%甲醛固定液中，制備肝臟石蠟切片，行免疫組化染色，用400倍顯微鏡觀察。以胞質(zhì)或胞膜染色呈棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞。以0.01 mmol/L PBS代替一抗作為空白對(duì)照。②Western blotting法：取肝臟組織，投入液氮中。肝臟組織勻漿后，提取肝臟組織總蛋白，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗原抗體反應(yīng)、放射自顯影，檢測(cè)肝臟組織NE及β-actin蛋白表達(dá)量。

1.4.5 肝臟組織NE、α1-AT水平 采用ELISA法。提取各組肝臟組織，標(biāo)本勻漿上清液，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書步驟完成加樣后，酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)量每孔OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各樣品中NE和α1-AT水平。計(jì)算NE/α1-AT比值。

1.4.6 肝臟組織促炎癥因子單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)及TNF-α mRNA表達(dá) 采用PCR法。應(yīng)用TRIzol提取各組肝臟組織標(biāo)本總RNA，采用超微量核酸測(cè)定儀測(cè)定RNA濃度，選取RNA OD260/OD280比值1.8～2.0的樣品，嚴(yán)格按照RT-PCR試劑盒和SYBR Select Master Mix試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增，以β-actin作為內(nèi)參基因。PCR引物序列來(lái)自Pubmed，由上海生物工程技術(shù)有限公司合成，序列如下：β-actin上游5′-CTGGCTCCTAGCACCATGAA-3′，下游5′-CGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3′；MCP-1上游5′-TCTCTCTTCCTCCACCACCAT-3′，下游5′-GCTCTCCAGCCTACTCATTGG-3′；TNF-α上游5′-AAGGGAGAGTGGTCAGGTTG-3′，下游5′-TCTGTGAGGAAGGCTGTGC-3′。用2-ΔΔCq方法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組血糖、IR變化比較 D0時(shí)，各組血糖及IR差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。D4時(shí)，GDM組血糖高于對(duì)照組(P均<0.05)，黃連素干預(yù)組血糖及IR與GDM組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。D8之后各時(shí)點(diǎn)，黃連素干預(yù)組血糖及IR均低于GDM組(P均<0.05)。見圖1。

注：A為各組血糖變化;B為各組IR變化。與對(duì)照組比較，#P<0.05；與GDM組比較，*P<0.05。

圖1 各組血糖、IR變化情況

2.2 各組體質(zhì)量、血脂、肝功能指標(biāo)比較 D0及D19時(shí)，GDM組和黃連素干預(yù)組大鼠體質(zhì)量、TC、TG、ALT、AST均高于對(duì)照組(P均 < 0.05)；而D0及D19時(shí),黃連素干預(yù)組大鼠上述指標(biāo)與GDM組大鼠比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 各組體質(zhì)量、血脂、肝功能指標(biāo)比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.3 各組胎鼠體質(zhì)量及胎盤質(zhì)量比較 D19時(shí)，GDM組胎鼠體質(zhì)量及胎盤質(zhì)量均高于對(duì)照組，黃連素干預(yù)組胎鼠體質(zhì)量及胎盤質(zhì)量均低于GDM組(P均<0.05)。見表2。

表2 各組胎鼠體質(zhì)量及胎盤質(zhì)量比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與GDM組比較，△P<0.05。

2.4 各組肝臟組織NE表達(dá)比較 ①免疫組化法：對(duì)照組肝臟組織幾乎沒有NE顯色，GDM組有較多的NE表達(dá)，黃連素干預(yù)組NE表達(dá)明顯減少，見圖2。②Western blotting法：分析亦顯示了上述類似結(jié)果，GDM組NE表達(dá)高于對(duì)照組，黃連素干預(yù)組NE表達(dá)低于GDM組(P均<0.05)，見圖3。

圖2 各組肝臟組織NE表達(dá)情況(免疫組化法，×40)

2.5 各組肝臟組織NE、α1-AT水平及NE/α1-AT比值比較 GDM組NE水平高于對(duì)照組，α1-AT水平低于對(duì)照組，NE/α1-AT比值高于對(duì)照組(P均<0.05)。黃連素干預(yù)組NE水平低于GDM組，α1-AT水平高于GDM組，NE/α1-AT比值低于GDM組(P均< 0.05)。見圖4。

注：與對(duì)照組比較，*P< 0.01；與GDM組比較，△P< 0.01。

圖3各組肝臟組織NE表達(dá)情況(Western blotting法)

注：A為各組NE比較;B為各組α1-AT比較;C為各組NE/α1-AT比較。與對(duì)照組比較，*P< 0.01；與GDM組比較，△P< 0.01。

圖4 各組肝臟組織NE、α1-AT水平及NE/α1-AT比值比較

2.6 各組肝臟組織MCP-1及TNF-α mRNA表達(dá)比較 GDM組MCP-1、TNF-α mRNA表達(dá)均高于對(duì)照組，黃連素干預(yù)組MCP-1、TNF-α mRNA表達(dá)均低于對(duì)照組(P均< 0.05)。見圖5。

注：A為各組MCP-1比較;B為各組TNF-α mRNA表達(dá)比較。與對(duì)照組比較，*P< 0.01；與GDM組比較，△P< 0.01。

圖5 各組肝臟組織MCP-1及TNF-α mRNA表達(dá)比較

3 討論

隨著人們生活水平的提高，肥胖發(fā)生率的升高，GDM的發(fā)生率也在不斷的上升，妊娠期高血糖不僅會(huì)增加母兒圍生期疾病危險(xiǎn)，而且將來(lái)母兒患2型糖尿病、心血管疾病的機(jī)會(huì)明顯增加。制作病理生理過(guò)程與人類相似的疾病模型對(duì)于疾病機(jī)制及治療的研究至關(guān)重要。僅僅通過(guò)STZ誘導(dǎo)的動(dòng)物模型通常更類似1型糖尿病，無(wú)法模擬以胰島素抵抗為主的GDM臨床特征，胎兒往往出現(xiàn)胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限。故本課題組首先通過(guò)高脂飼料喂養(yǎng)導(dǎo)致大鼠肥胖，形成一定的胰島素抵抗后再予以小劑量STZ誘導(dǎo)，另外由于大鼠的自我修復(fù)能力較強(qiáng)，部分大鼠在成模后第4天出現(xiàn)血糖恢復(fù)的情況，我們?cè)诔赡：蟮?天予以更小劑量STZ補(bǔ)充注射，使大鼠血糖維持穩(wěn)定，并提高了大鼠的成模率。

胰島素抵抗是GDM患者的顯著病理生理特征。但目前針對(duì)GDM患者的治療唯一安全有效的藥物只有胰島素，而胰島素并不能改善GDM患者的病理生理狀態(tài)。而且部分研究顯示胰島素可能增加患者體質(zhì)量[6, 7]。二甲雙胍可以改善胰島素抵抗，但因其可以透過(guò)胎盤[8]，有導(dǎo)致胎兒早產(chǎn)及增加后代體質(zhì)量的不良影響[9]。所以亟需尋找安全有效，可以改善GDM患者病理生理紊亂的藥物。

黃連素是從多年生草本植物黃連、三角葉黃連或云連的根莖，即黃連中提取到的一種有效化學(xué)成分，另有多種植物中也含有黃連素。由于其天然，毒副作用小，應(yīng)用前景極其廣闊，具有降血糖、降血脂和改善胰島素抵抗的作用。既往研究顯示，黃連素可以通過(guò)抑制炎癥因子改善肥胖及2型糖尿病胰島素抵抗。Jiang等[10]研究證實(shí)，黃連素可以通過(guò)使IκB-β第181位氨基酸殘基磷酸化而抑制NF-κB；而Xie等[11]發(fā)現(xiàn)，黃連素還可以通過(guò)抑制Rho GTP酶信號(hào)通路抑制NF-κB，進(jìn)而減少炎癥因子的釋放。此外黃連素還可以通過(guò)AMPK通路抑制巨噬細(xì)胞分泌促炎因子誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、環(huán)氧合酶2[12]。黃連素已經(jīng)被證實(shí)在治療與胰島素抵抗為主要特征的疾病時(shí)(如2型糖尿病、高脂血癥、多囊卵巢綜合征等)具有良好療效。本研究旨在GDM大鼠模型中觀察黃連素對(duì)其胰島素抵抗的作用。本研究顯示，GDM組體質(zhì)量、TC、TG、ALT、AST及IR均高于對(duì)照組，GDM組胎鼠體質(zhì)量及胎盤質(zhì)量均高于對(duì)照組，表明GDM大鼠體質(zhì)量、血糖、血脂均顯著升高，并出現(xiàn)肝功能異常、嚴(yán)重胰島素抵抗，導(dǎo)致其胎鼠出生體質(zhì)量及胎盤質(zhì)量均顯著升高；黃連素干預(yù)組體質(zhì)量、TC、TG、ALT、AST及IR均低于GDM組，胎鼠體質(zhì)量及胎盤質(zhì)量均低于GDM組，表明黃連素干預(yù)后對(duì)GDM大鼠具有顯著改善胰島素抵抗、降血糖和降低胎鼠體質(zhì)量的作用。

慢性低度組織炎癥是系統(tǒng)性胰島素抵抗的重要原因，并且是肥胖和2型糖尿病患者胰島素敏感性下降的關(guān)鍵因素[13, 14]。研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞激活后將募集巨噬細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞產(chǎn)生大量TNF-α、IL-1β和IL-6等炎癥因子[15～17]。MCP-1屬于趨化因子CC亞族成員，其高表達(dá)可通過(guò)促進(jìn)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)導(dǎo)致慢性低度炎癥的發(fā)生，既往有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)其在非酒精性脂肪肝、肥胖、糖尿病等胰島素抵抗相關(guān)性疾病中高表達(dá)[5]，與本研究結(jié)果相一致。Mansuy-Aubert等[5]在高脂飼料喂養(yǎng)小鼠肝臟組織中發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，并通過(guò)分泌NE，降低胰島素受體底物1導(dǎo)致胰島素抵，而NE敲除小鼠炎癥反應(yīng)明顯減輕，胰島素敏感性增加。Maria等[18]的體外研究顯示，GDM患者的中性粒細(xì)胞活性增加，中性粒細(xì)胞胞外陷阱和NE水平升高。所以NE可能在導(dǎo)致胰島素抵抗中起著非常重要的作用。而與NE對(duì)應(yīng)的α1-AT則是保護(hù)組織免受絲氨酸蛋白酶損害的的一種物質(zhì)[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，GDM組NE水平高于對(duì)照組，α1-AT水平低于對(duì)照組，NE/1-AT比值高于對(duì)照組，提示GDM大鼠存在NE過(guò)度分泌的情況，作為與其對(duì)應(yīng)的抗炎因子α1-AT則明顯下降，NE/α1-AT升高；黃連素干預(yù)組NE水平低于GDM組，α1-AT水平高于GDM組，NE/α1-AT比值低于GDM組，提示黃連素干預(yù)后上述指標(biāo)均有明顯改善，炎癥因子表達(dá)的不平衡現(xiàn)象也得到了改善；GDM組MCP-1、TNF-α mRNA表達(dá)均高于對(duì)照組，黃連素干預(yù)組MCP-1、TNF-α mRNA表達(dá)均低于對(duì)照組，提示妊娠期糖尿病大鼠肝臟組織NE/α1-AT比例的失衡可能促進(jìn)了單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的募集，導(dǎo)致過(guò)多的促炎因子的釋放，進(jìn)而導(dǎo)致大鼠胰島素抵抗的發(fā)生，而黃連素可能正是通過(guò)改善上述通路發(fā)揮其有效作用，而不是通過(guò)調(diào)節(jié)血脂紊亂實(shí)現(xiàn)的。