范曉英，薛沙，李靜，張萬(wàn)平，鄭仲磊

西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，西安710038

心血管疾病是臨床常見(jiàn)的疾病，缺血再灌注損傷是一種常見(jiàn)的臨床并發(fā)癥[1]，如何解決這一難題在臨床上具有重要意義。異氟烷是臨床常用的吸入麻醉藥，可減少出現(xiàn)缺血再灌注損傷的可能[2～4]，有研究結(jié)果顯示這與多條信號(hào)通路被激活有關(guān)，機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，其中十分重要的一條信號(hào)通路可能是p38有絲分裂原激活蛋白激酶(MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。若可及時(shí)阻斷或抑制該通路或許可以預(yù)防缺血再灌注損傷的發(fā)生，但是目前這一觀點(diǎn)還缺乏有效的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。2018年12月～2019年3月，我們通過(guò)手術(shù)結(jié)扎冠狀動(dòng)脈的方式制備心肌缺血再灌注損傷大鼠模型，并給予p38 MAPK抑制物異氟烷吸入進(jìn)行處理，探討吸入異氟烷對(duì)心肌缺血再灌注損傷的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑 健康成年SPF級(jí)SD大鼠48只，雌雄各半，體質(zhì)量200～300 g。HRPO標(biāo)記羊抗兔IgG(1.0 g/L)(深圳晶美生物公司)、p38MAPK和p-p38一抗(Bioworld公司)、BSA(Roche，北京索萊寶科技有限公司)、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(中國(guó)碧云天生物技術(shù)公司)、BCA蛋白定量試劑盒、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所)等。

1.2 動(dòng)物分組及心肌缺血再灌注損傷模型制備 將48只大鼠按照隨機(jī)分組原則分為假手術(shù)組、異氟烷+假手術(shù)組、模型組和模型+異氟烷組，每組12只。模型組、模型+異氟烷組參考相關(guān)文獻(xiàn)[5～7]采用冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎，制備心肌缺血再灌注損傷模型：手術(shù)前進(jìn)行全身麻醉，固定于解剖板上，剪開(kāi)胸部皮膚，從第5肋間開(kāi)始從下而上沿前正中線和左側(cè)鎖骨中線剪開(kāi)胸壁和心包，暴露心臟，在左心耳下緣處用5406-0無(wú)損傷縫合線穿入左冠狀動(dòng)脈前降支，平穩(wěn)30 min后結(jié)扎(以心外膜變成灰白色、心電圖出現(xiàn)ST段呈弓背向上變化為發(fā)生心肌缺血)，缺血30 min后，解開(kāi)結(jié)扎的冠狀動(dòng)脈左前降支，恢復(fù)血液再灌注3 h，制備心肌缺血再灌注損傷模型。假手術(shù)組、假手術(shù)+異氟烷組僅開(kāi)胸穿線不結(jié)扎。

1.3 干預(yù)方法 假手術(shù)+異氟烷組和模型+異氟烷組造模后利用異氟烷揮發(fā)罐吸入濃度為1.0 MAC(1.38%)的異氟烷，吸入時(shí)間為30 min，吸入完成后需排出15 min。假手術(shù)組和模型組造模后吸入氧氣代替異氟烷進(jìn)行干預(yù)。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 心功能 吸入異氟烷后或相同時(shí)間點(diǎn)，利用生物機(jī)能系統(tǒng)監(jiān)測(cè)動(dòng)物的心功能指標(biāo)，包括射血分?jǐn)?shù)(EF)、短軸縮短率(FS)、左室收縮期平均壓(LVSP)和左室舒張末期壓力(LVEDP)。

1.4.2 心肌缺血程度及梗死程度 快速腹腔注射大劑量烏拉坦處死動(dòng)物，迅速取下心臟，用生理鹽水沖洗后，垂直于心臟縱軸將心臟切為5片。用TTC復(fù)染15 min后迅速投入4%中性多聚甲醛中固定，高清相機(jī)拍攝照片，導(dǎo)入Image pro plus 6.0軟件，計(jì)算心肌梗死程度和缺血程度。正常面積為藍(lán)色，梗死面積為白色，缺血面積為紅色。缺血程度=缺血面積/正常面積×100%，梗死程度=梗死面積/缺血面積×100%。

1.4.3 心肌組織病理學(xué)改變 采用HE染色法。取梗死心肌組織行HE染色，200倍光鏡下觀察病理學(xué)改變。

1.4.4 心肌組織p-p38、p38含量 采用Western blotting法檢測(cè)。取梗死心肌組織，加入9倍體積的預(yù)冷細(xì)胞裂解液手動(dòng)勻漿，取上清液用BCA試劑盒定量，每個(gè)樣本取15 μg蛋白進(jìn)行分離鑒定。切取目的蛋白所在范圍條帶，用半干轉(zhuǎn)膜儀將目的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，加入一抗4度孵育過(guò)夜(兔抗大鼠p-p38、兔抗大鼠p38)，除去一抗后加入羊抗兔二抗室溫孵育2 h，除去二抗后用ECL法顯色，Kodak膠片曝光后讀取灰度值并截圖分析，比較各組p-p38/p38比值。

1.4.5 心肌組織MDA、SOD含量 處死動(dòng)物后迅速取下心臟，生理鹽水沖洗，加入9倍體積預(yù)冷生理鹽水在冰盒上手動(dòng)勻漿，離心10 min，取上清液,采用MDA和SOD試劑盒檢測(cè)MDA和SOD含量。

2 結(jié)果

2.1 各組心功能指標(biāo)比較 與假手術(shù)組相比，模型組LVEDP升高，EF、FS、LVSP均降低(P均<0.05)；與模型組相比，模型+異氟烷組LVEDP降低，EF、FS、LVSP均升高(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組心功能指標(biāo)比較

注：與假手術(shù)組比較，﹟P<0.05；與假手術(shù)+異氟烷組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。

2.2 各組心肌缺血程度及梗死程度比較 與假手術(shù)組相比，模型組心肌缺血程度及梗死程度均增高(P均<0.05)；與模型組比較，模型+異氟烷組心肌缺血程度及梗死程度均降低(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組心肌缺血程度及梗死程度比較

注：與假手術(shù)組比較，﹟P<0.05；與假手術(shù)+異氟烷組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。

2.3 各組心肌病理學(xué)改變 假手術(shù)組和假手術(shù)+異氟烷組未見(jiàn)任何異常；模型組明顯可見(jiàn)心肌細(xì)胞壞死，心肌纖維溶解、斷裂，間隙明顯增寬;模型+異氟烷組心肌細(xì)胞損傷得到明顯改善，偶見(jiàn)斷裂、溶解、壞死的心肌纖維和間隙增寬，見(jiàn)圖1。

注：a為模型+異氟烷組，b為模型組，c為假手術(shù)組，d為假手術(shù)+異氟烷組。

圖1 各組心肌病理學(xué)改變(HE染色法)

2.4 各組心肌組織p-p38、p38含量比較 假手術(shù)組、假手術(shù)+異氟烷、模型組、模型+異氟烷p-p38/p38比值分別為0.19±0.06、0.20±0.09、0.71±0.06、0.50±0.09，模型組p-p38/p38比值高于假手術(shù)組(P<0.05)，模型+異氟烷組p-p38/p38比值低于模型組(P<0.05)，假手術(shù)+異氟烷組與假手術(shù)組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 各組心肌組織p-p38、p38蛋白表達(dá)情況(Western blotting法)

2.5 各組心肌組織MDA、SOD含量比較 與假手術(shù)組相比，模型組心肌組織MDA含量增高、SOD活性降低(P均<0.05)；與模型組比較，模型+異氟烷組MDA活性降低、SOD活性增高(P均<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組心肌組織MDA、SOD含量比較

注：與假手術(shù)組比較，﹟P<0.05；與假手術(shù)+異氟烷組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。

3 討論

目前有關(guān)心肌再灌注損傷的機(jī)制仍不明朗。已有研究表明，心肌再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制受多種因素的影響，包括代謝紊亂、氧自由基大量釋放、炎癥反應(yīng)和鈣離子超載等。一旦出現(xiàn)缺血再灌注損傷，不僅使患者心功能大大降低，還限制了臨床治療效果，例如心臟搭橋手術(shù)、介入治療、溶栓術(shù)等[8]。磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的p38 MAPK信號(hào)通路參與多種生物學(xué)行為的調(diào)控，由多種細(xì)胞因子和酶共同參與，若該通路被激活，將會(huì)引起心肌細(xì)胞的凋亡和壞死，活化中性粒細(xì)胞，增加細(xì)胞活素類物質(zhì)和黏附分子的表達(dá)量，使胞質(zhì)蛋白質(zhì)和逆轉(zhuǎn)錄因子磷酸化，從而加劇心肌缺血再灌注損傷。因此，通過(guò)降低p38 MAPK通路的活性，可能會(huì)抑制甚至逆轉(zhuǎn)心肌缺血再灌注損傷，從而恢復(fù)受損的心臟功能。

已有研究證實(shí)，異氟烷可有助于恢復(fù)患者的心臟功能，其作用機(jī)制復(fù)雜，可從多個(gè)方面發(fā)揮作用，一方面異氟烷可作用于KATP通道，從而加快冠狀動(dòng)脈血流速度，增加血流量，舒張冠狀動(dòng)脈；另一方面異氟烷可以與細(xì)胞膜上的L型鈣通道結(jié)合，從而阻止鈣離子內(nèi)流，降低心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，加強(qiáng)細(xì)胞膜的作為心肌細(xì)胞的第一道防線作用。除此之外，異氟烷還可減少心肌細(xì)胞凋亡，抑制炎性因子的生成與釋放，抑制線粒體膜通透轉(zhuǎn)換孔道開(kāi)放，誘導(dǎo)熱休克蛋白的表達(dá)，這些共同作用從而發(fā)揮心臟保護(hù)功能。本研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，模型組LVEDP升高，EF、FS、LVSP均降低，表明心肌缺血再灌注可抑制大鼠心臟功能；與模型組相比，模型+異氟烷組各項(xiàng)心臟功能均得到改善，表明在心肌缺血再灌注損傷過(guò)程中給予異氟烷干預(yù)可抵抗這種損傷，保護(hù)心臟功能。

對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行梗死程度和缺血程度分析，是評(píng)價(jià)心肌保護(hù)作用的金標(biāo)準(zhǔn)。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，模型+異氟烷組心肌缺血程度和梗死程度均降低，表明心肌缺血后給予吸入異氟烷干預(yù)，可降低心肌細(xì)胞的缺血程度和梗死程度，提示給予異氟烷干預(yù)可有效抑制心肌缺血再灌注損傷，降低心肌梗死程度。

心肌缺血再灌注損傷所致的病理變化主要為心肌纖維斷裂、排列紊亂、心肌纖維間隙增寬、心肌細(xì)胞溶解壞死等，可導(dǎo)致心力衰竭、心功能紊亂、心肌細(xì)胞功能異常[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組可見(jiàn)心肌細(xì)胞壞死，而模型+異氟烷組心肌細(xì)胞損傷得到明顯改善，表明給予異氟烷干預(yù)可有效緩解心肌損傷。

MAPK是人體內(nèi)存在的一種很重要的酶，參與機(jī)體多種生理過(guò)程，包括細(xì)胞增殖、基因表達(dá)等，與細(xì)胞的凋亡、存活、分化、生長(zhǎng)等密切相關(guān)[10]。MAPK可通過(guò)炎癥因子、高滲環(huán)境、熱休克、缺血再灌注損傷等途徑激活，p-p38和p38就是其中一條重要的信號(hào)通路。研究顯示，該通路的活化可加重機(jī)體的損傷[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組p-p38/p38比值高于假手術(shù)組，表明缺血再灌注損傷的心肌中磷酸化的p38所占比例更高；模型+異氟烷組p-p38/p38比值低于模型組，表明心肌細(xì)胞在缺血再灌注損傷過(guò)程中給予異氟烷干預(yù)可有效抑制p38磷酸化，保護(hù)心肌免受損害。

研究顯示，體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)與缺血再灌注損傷有密不可分的關(guān)系。MDA和SOD是反映氧化應(yīng)激反應(yīng)最常用也是最敏感的指標(biāo)。體內(nèi)清除氧自由基很大程度上依賴于SOD，其活性高低直接影響自由基清除能力，清除體內(nèi)自由基可幫助機(jī)體免于氧化損傷，也避免了缺血再灌注損傷的加重；體內(nèi)在受到氧化應(yīng)激損傷的同時(shí)，膜脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)也會(huì)增強(qiáng)，進(jìn)一步加重?fù)p傷，這一過(guò)程的終產(chǎn)物就是MDA，若機(jī)體受到氧化應(yīng)激損傷，則其含量會(huì)隨之增高，細(xì)胞也會(huì)因此嚴(yán)重受損，自由基生產(chǎn)增加[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，模型+異氟烷組MDA活性降低、SOD活性增高，表明心肌缺血后給予異氟烷干預(yù)可明顯增強(qiáng)SOD的活性、降低MDA的含量，提示給予異氟烷不僅可以增強(qiáng)機(jī)體清除自由基的能力，還可抑制膜脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，減少自由基的產(chǎn)生，有效降低機(jī)體所受的氧化應(yīng)激損傷，最終使缺血再灌注損傷程度降低。

綜上所述，吸入異氟烷可有效恢復(fù)缺血再灌注損傷大鼠的心臟功能，改善心肌細(xì)胞的病理變化，減少心臟的梗死程度和缺血程度，其機(jī)制可能為抑制p38MAPK信號(hào)通路活化、減少氧化應(yīng)激損傷。