孫亦鵬，倪振華，張孟哲，畢俊杰，林玉華，王雄彪

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院，上海200062

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，也是導(dǎo)致癌癥死亡的主要原因，并帶來巨大的社會和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。傳統(tǒng)的化療藥不良反應(yīng)大、容易產(chǎn)生耐藥；靶向藥物盡管取得了一定的療效，但存在耐藥、易復(fù)發(fā)等問題[1]。羥基喜樹堿(HCTP)是由珙桐科植物喜樹的果實、葉提取的喜樹堿進(jìn)一步合成而得，對肺癌、宮頸癌、神經(jīng)母細(xì)胞癌等都具有抗癌作用[2～4]，與化療藥物或靶向藥聯(lián)用可增加療效，但其具體作用機(jī)制有待深入研究。研究表明，凋亡的失調(diào)是導(dǎo)致肺癌的發(fā)生、浸潤和轉(zhuǎn)移的機(jī)制之一[5]。而wnt/β-catenin通路在調(diào)節(jié)凋亡的過程中起到重要作用，抗癌藥β-Asaron誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制就是抑制了β-catenin蛋白的表達(dá)，用β-catenin的激活劑可逆轉(zhuǎn)該藥的致凋亡作用[6]。2018年10月～2019年9月，我們用不同濃度的HCPT處理A549肺癌細(xì)胞，觀察HCPT對A549細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑與儀器 A549人肺癌細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫，培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。HCPT(selleck公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基(Thermo公司)；胎牛血清(Hyclone公司)；CCK-8、Annexin V和PI(Dojindo公司)；二甲基亞砜(Amresco公司)；Caspase-8活性檢測試劑盒(Promega公司)；蛋白裂解液(碧云天公司)；Bcl-2(#2876)、Bcl-xl(#2764)、β-catenin(#9582)、羊抗兔二抗(#7074)、羊抗鼠二抗(#7076)購自CST公司；β-actin(ab6276，Abcam公司)；Powerpac基礎(chǔ)型電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、化學(xué)發(fā)光成像儀(Bio-Rad公司)。

1.2 HCPT溶液配制 按照說明書，將HCPT配制成不同終濃度(5、10 mmol/L)的溶液，DMSO終濃度<0.1%。

1.3 細(xì)胞分組 用0、5、10 μmol/L的 HCPT處理細(xì)胞，將細(xì)胞分為對照組、HCPT-5組和HCPT-10組。

1.4 細(xì)胞增殖情況檢測 采用CCK-8實驗。將各組細(xì)胞以1×104/孔接種于96孔培養(yǎng)板，每組重復(fù)12孔。在細(xì)胞對數(shù)生長期，對照組、HCPT-5組和HCPT-10組分別加入0、5、10 μmol/L的HCPT干預(yù)24 h或48 h，棄培養(yǎng)基，加入CCK-8，繼續(xù)孵育3 h。在酶聯(lián)免疫檢測儀上選擇波長450 nm處，測定各實驗孔OD值。細(xì)胞生存率=HCPT處理組OD值/對照組OD值×100%。

1.5 細(xì)胞凋亡情況檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)。取對數(shù)生長期A549細(xì)胞，以3×105/mL接種于6孔培養(yǎng)皿，培養(yǎng)密度達(dá)60%～70%。對照組、HCPT-5組和HCPT-10組分別加入0、5、10 μmol/L的HCPT干預(yù)48 h，收集細(xì)胞，PBS漂洗，采用Annexin V/PI細(xì)胞凋亡試劑盒檢測凋亡細(xì)胞比例。每組重復(fù)3次。各組細(xì)胞凋亡率為Annexin V(+)、PI(+)與Annexin V(+)、PI(-)之和。

1.6 Caspase-8活性檢測 采用生物熒光法。收集A549細(xì)胞，以1×104/孔細(xì)胞接種于96孔板。細(xì)胞培養(yǎng)過夜后，對照組、HCPT-5組和HCPT-10組分別加入0、5、10 μmol/L 的HCPT干預(yù)48 h后，每孔加入100 μL Caspase-8底物，混合孵育3 h后，采用Promega GloMax 20/20發(fā)光檢測儀檢測各孔吸光值。

1.7 Bcl-2、Bcl-xl和β-catenin蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法。將各組細(xì)胞以密度為5×105接種在6孔板中培養(yǎng)。對照組、HCPT-5組和HCPT-10組分別加入0、5、10 μmol/L的HCPT干預(yù)24 h或48 h。用PBS漂洗后，加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解15 min，12 000 r/min離心，收集上清液。用BCA法對蛋白樣品定量后，加入蛋白上樣緩沖液，金屬浴100 ℃加熱10 min充分變性蛋白。經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白組分，將蛋白轉(zhuǎn)印于PVDF膜上，5%BSA室溫封閉2 h，分別加入Bcl-2、Bcl-xl、β-catenin和β-actin抗體，4 ℃孵育過夜，次日TBST溶液漂洗10 min×3次，加入HRP標(biāo)記的二抗，TBST溶液漂洗10 min×3次，ECL顯色后膠片曝光。最終結(jié)果用Image J分析相對表達(dá)量。以目的蛋白與β-actin灰度比值表示各目的蛋白的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖情況比較 與對照組相比，HCPT-5和HCPT-10組的細(xì)胞生存率降低，且HCPT-10組細(xì)胞生存率低于HCPT-5組(P均<0.01)。見表1。

表1 各組細(xì)胞增殖情況比較

注：與對照組相比，aP<0.01；與HCPT-5組相比，bP<0.01。

2.2 各組細(xì)胞凋亡率比較 對照組、HCPT-5組、HCPT-10組細(xì)胞凋亡率分別為1.73%±0.32%、27.99%±4.38%、38.1%±4.45%，與對照組相比，HCPT-5組和HCPT-10組細(xì)胞凋亡率均增高(P均<0.01)，并且HCPT-10組細(xì)胞凋亡率高于HCPT-5組(P<0.01)，見圖1。

圖1 HCPT對A549細(xì)胞凋亡的影響(流式細(xì)胞術(shù))

2.3 各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較 與對照組相比，在藥物處理48 h后，HCPT-5、HCPT-10組的Bcl-2蛋白表達(dá)均下降(P均<0.01)；HCPT-5、HCPT-10組的Bcl-xl蛋白表達(dá)均下降(P均<0.01)；HCPT-5和HCPT-10組的Caspase-8活性均增高(P均<0.01)，見圖2、表2。

圖2 各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況(Western blotting法)

組別Bcl-2/β-actinBcl-xl/β-actinCasoase-8活性(×104)對照組1.00±0.001.00±0.0046.55±10.28HCPT-5組0.95±0.130.78±0.09a153.90±19.50HCPT-10組0.58±0.09bc0.44±0.11bc177.02±37.94

注：與對照組相比，aP<0.05，bP<0.01;與HCPT-5組相比，cP<0.01。

2.4 各組細(xì)胞β-catenin蛋白表達(dá)比較 與對照組相比，藥物處理24、48 h后，HCPT-5組和HCPT-10組β-catenin蛋白表達(dá)均降低(P均<0.01)。見圖3、表3。

圖3 HCPT對β-catenin蛋白表達(dá)的影響

表3 各組細(xì)胞β-catenin蛋白表達(dá)比較

注：與對照組相比，aP<0.05，bP<0.01;與HCPT-5組相比，cP<0.01。

3 討論

肺癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，據(jù)估測，2018年新發(fā)肺癌病例為234 030例，死亡病例為158 770例[7]。由于大多數(shù)肺癌患者在發(fā)現(xiàn)時已是晚期或者已有轉(zhuǎn)移(ⅢB或Ⅳ)，無法手術(shù)早期切除，因而目前在肺癌治療上，化療仍然是重要的治療手段。然而，化療對部分患者并不敏感，而且存在不良反應(yīng)大、容易耐藥等問題。靶向藥物是近年肺癌治療上的重大突破，但靶向藥物不適用于小細(xì)胞肺癌的治療，而且靶向藥物也存在耐藥和復(fù)發(fā)問題[8]。中草藥以其獨特的優(yōu)勢在肺癌治療上可有效彌補(bǔ)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的缺憾。

HCPT是從植物喜樹的果實或葉中提取并進(jìn)一步加工而成。喜樹，《中華本草》記載其具有“清熱解毒，散結(jié)消癥”之功效。名老中醫(yī)張士舜[9]靈活運用喜樹果治療肺腺癌效果顯著?，F(xiàn)代藥理研究表明，HCPT可干擾DNA S期復(fù)制和RNA轉(zhuǎn)錄，從而抑制核酶拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ的活性，對多種腫瘤都具有抑制作用[10]；可誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞發(fā)生自噬從而發(fā)揮腫瘤殺傷作用[2]。HCPT聯(lián)合其它藥物可增強(qiáng)抗腫瘤作用。比如HCPT聯(lián)合雷公藤內(nèi)酯可激活PP2A介導(dǎo)的信號通路增強(qiáng)對肺癌細(xì)胞的凋亡作用[11]；羥基喜樹堿聯(lián)合化療栓塞治療中晚期肝癌取得良好效果[12]；吉非替尼聯(lián)合HCPT心包灌注可改善攜帶EGFR突變和惡性心包積液的晚期非小細(xì)胞肺癌患者的無進(jìn)展生存期[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，HCPT-5組和HCPT-10組細(xì)胞生存率均低于對照組，表明HCPT可抑制A549細(xì)胞的增殖；HCPT-5組和HCPT-10組

的凋亡率均高于對照組，并且HCPT-5組和HCPT-10組的Bcl-2和Bcl-xl蛋白表達(dá)低于對照組、Caspase-8活性高于對照組，這表明HCPT可激活Caspase-8活性、抑制Bcl家族蛋白，從而在細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)水平誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡。

Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是一條在生物進(jìn)化中極為保守的通路，其中β-catenin是Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的一個關(guān)鍵下游效應(yīng)分子。在正常的體細(xì)胞中，β-catenin只是作為一種細(xì)胞骨架蛋白，在胞膜處與E-cadherin形成復(fù)合體，對維持同型細(xì)胞的黏附、防止細(xì)胞的移動發(fā)揮作用[14]。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Wnt信號激活時，β-catenin在胞質(zhì)中積累起來并進(jìn)入細(xì)胞核與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子家族作用，并促進(jìn)特定基因的表達(dá)。已有研究證實，Wnt/β-catenin信號通路在肺癌的的發(fā)生中被異常激活，并且與肺癌患者生存密切相關(guān)[15]。在肺癌細(xì)胞中，通過藥物抑制β-catenin的表達(dá)可以顯著抑制肺癌細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞的凋亡[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，HCPT-5組和HCPT-10組的β-catenin蛋白表達(dá)低于對照組，表明HCPT誘導(dǎo)凋亡可能與Wnt/β-catenin通路有關(guān)。

綜上所述，HCPT可抑制A549肺癌細(xì)胞的增殖、促進(jìn)其凋亡，其機(jī)制可能與抑制β-catenin的表達(dá)有關(guān)。