解小霞，孫曉靜，蘇文煬 ，楊柳，李力，王薇，李婷，田永強(qiáng)

1武漢市中醫(yī)醫(yī)院，武漢430014；2湖北省中醫(yī)院

急性心肌梗死(AMI)是臨床常見的冠狀動脈疾病之一，可導(dǎo)致冠狀動脈供血減少、機(jī)體組織缺氧等癥狀，嚴(yán)重者在數(shù)分鐘內(nèi)發(fā)生心臟停搏[1]。心肌細(xì)胞凋亡、心室重構(gòu)、心肌纖維化等均是心肌梗死后心肌細(xì)胞病變代償?shù)闹匾±砩磉^程[2]。微小RNA(miRNA)是一類非編碼RNA序列，通過與靶基因特異性結(jié)合抑制靶基因表達(dá)。研究顯示，人體內(nèi)約有半數(shù)以上的基因受miRNA的直接或間接調(diào)控，miRNA的異常表達(dá)與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3]。在AMI進(jìn)展過程中存在miRNA的異常表達(dá)譜，特異性表達(dá)的miRNA可作為AMI早期診斷的分子標(biāo)記物[4]。2017年8月～2018年12月，本研究通過觀察AMI患者血漿miR-125b的表達(dá)量，以及miR-125b對人心肌細(xì)胞HCM凋亡與增殖活力的影響，以炎癥、免疫系統(tǒng)平衡為切入點，探討miR-125b對人心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，為AMI的防治提供有效治療策略。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年8月～2018年12月在我院心內(nèi)科診治的AMI患者68例為AMI組。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡30～75歲；符合AMI的相關(guān)診斷；肌鈣蛋白I(cTnI)水平>0.1 ng/mL或肌酸肌酶同工酶(CK-MB)水平升高1倍；心電圖ST段抬高或壓低以及新發(fā)生存活心肌的丟失或者節(jié)段性室壁運(yùn)動異常的影像學(xué)證據(jù)；心電圖上出現(xiàn)病理性Q波，胸痛持續(xù)時間大于20 min。排除標(biāo)準(zhǔn)：心律失常、心力衰竭等心臟疾病、惡性腫瘤及其他免疫系統(tǒng)疾病等，另收集體檢健康對照者50例作為正常對照組，排除心血管疾病、惡性腫瘤以及其他免疫系統(tǒng)疾病。所有受試者均簽署患者知情同意書并通過倫理審查。

1.2 細(xì)胞與試劑 人心肌細(xì)胞HCM細(xì)胞購于中科院上海細(xì)胞庫。Lipofectamine 3000購自美國Invitrogen公司，real-time PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司，TRIzol試劑來自美國Thermo Fisher Scientific公司，RIPA裂解緩沖液購自上海碧云天生物科技有限公司，MTT試劑盒購自南京凱基生物技術(shù)有限公司，青霉素、鏈霉素購自Gibco BRL公司，熒光素酶檢測試劑購自Promega北京生物技術(shù)有限公司，熒光素酶報告載體由Promega公司合成，Annexin V/PI檢測試劑盒購自上海碧云天公司。流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。miR-125b模擬物序列為5′-UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA-3′，miR-125b引物序列為:5′-CTGGTCCTAGTCAAATACCCCA-3′，3′-ACGCAAATTCGTGAACGTT-5′。miR-125b mimics購自上海吉瑪生物制藥有限公司。GAPDH、炎性小體(NLRP3)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、趨化因子2(CCL2)、趨化因子C-X3-C-配體1(CX3CL1)、補(bǔ)體應(yīng)答基因-32(RGC32)兔抗人的單克隆抗體購自Abcam公司。

1.3 血清miR-125b表達(dá)檢測 空腹采集所有研究對象的靜脈血3～5 mL，3 000 r/min離心10 min，取上清1 mL。采用TRIzol一步法提取總RNA并純化，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，實時熒光定量PCR法檢測miR-125b表達(dá)情況。引物序列：miR-125b-F為5′-CTGGTCCTAGTCAAATACCCCA-3′，miR-125b-R為5′-ACGCAAATTCGTGAACGTT-3′；U6-F為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，U6-R為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反應(yīng)參數(shù)：90～95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，PCR反應(yīng)進(jìn)行30個循環(huán)，72℃延伸10 min，反應(yīng)體系為20 μL，以U6為內(nèi)參，所得數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進(jìn)行表達(dá)量相對定量分析。

1.4 細(xì)胞增殖活力檢測 采用CCK-8法測定HCM細(xì)胞相對增殖率的影響。取對數(shù)生長期HCM細(xì)胞，加入DMEM培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL，接種于96孔板中，吸棄細(xì)胞培養(yǎng)基，加入PBS輕洗細(xì)胞2次，分別采用瞬時轉(zhuǎn)染法將miR-125b mimics(濃度分別為200、100、50 nmol/L)及NC mimics(濃度分別為200、100、50 nmol/L)轉(zhuǎn)染入HCM細(xì)胞，轉(zhuǎn)染8 h后去除轉(zhuǎn)染液，加入1 mL的OPTI-MEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h及48 h。在熒光顯微鏡下觀察示，轉(zhuǎn)染效率達(dá)90%以上，表明轉(zhuǎn)染條件可靠。加入配好的含10%CCK-8試劑的培養(yǎng)基，同時設(shè)置空白對照。37 ℃孵育1 h，用微型超聲振蕩器混勻后，在酶標(biāo)儀上以試驗波長為570 nm，參比波長為450 nm測定光密度值。細(xì)胞相對增殖率(%)=[(B-A)/B×100%]，A為miR-125b mimics或NC mimics轉(zhuǎn)染組OD值，B為空白組OD值。每個實驗重復(fù)3次，每次測量3次。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)。將密度為1×105個/mL的HCM細(xì)胞接種于12孔板，吸棄細(xì)胞培養(yǎng)基，加入PBS輕洗細(xì)胞3次，除空白組外，2 h后吸去培養(yǎng)基，按上述miRNA mimics瞬時轉(zhuǎn)染步驟進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染，使miR-125b mimics終濃度分別為50、100 nmol/L，轉(zhuǎn)染NC mimics終濃度為100 nmol/L，另設(shè)空白組，轉(zhuǎn)染后于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。加入胰酶消化細(xì)胞，PBS洗3次，分別加入5 μL FITC-annexin V和2 μL PI，常溫下避光孵育10 min，補(bǔ)齊總體積至500 μL，4 ℃冰浴避光放置。過濾后在流式細(xì)胞儀上測定細(xì)胞早期凋亡的百分比。

1.6 細(xì)胞免疫、炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法檢測細(xì)胞免疫、NLRP3、IL-1β、CCL2、CX3CL1、RGC32表達(dá)。按上述miRNA mimics瞬時轉(zhuǎn)染步驟進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染，使miR-125b mimics終濃度為200 nmol/L，另設(shè)NC mimics組(終濃度為100 nmol/L)、空白組，取對數(shù)生長期各組細(xì)胞，胰酶消化后加入細(xì)胞裂解液(RIPA)50 μL裂解細(xì)胞提取總蛋白，采用Bradford方法進(jìn)行蛋白定量。采用SDS-PAGE電泳分離總蛋白，每道孔上樣50 μg總蛋白質(zhì)，電泳2 h后，采用濕法轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，將膜用5%脫脂奶粉封閉1 h，4 ℃孵育一抗(1∶1 000稀釋)過夜，次晨采用TBST漂洗膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶3 000稀釋)，37 ℃孵育1 h，ECL顯影，保存圖像，以β-actin為對照，采用Quantity One側(cè)光密度值。實驗重復(fù)3次。

1.7 miR-125b靶基因進(jìn)行預(yù)測 采用熒光素酶實驗。利用Targetscan、miRanda數(shù)據(jù)庫對miR-125b靶基因進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NLRP3與miR-125b存在9個連續(xù)的堿基互補(bǔ)配對。為檢測miR-125b是否能夠識別NLRP3-3′UTR區(qū)域，構(gòu)建包含NLRP3 3′UTR(wt)區(qū)域以及熒光素酶報告基因的質(zhì)粒，將質(zhì)粒與100 nmol/L miR-125b mimics或100 nmol/L NC mimics共同轉(zhuǎn)染入HCM細(xì)胞，使用雙熒光素酶報告基因測定試劑盒，轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行螢光素酶測定，實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 AMI組與正常對照組患者血清miR-125b水平比較 AMI組、正常對照組血清miR-125b水平分別為0.26±0.05、1.02±0.08，AMI組血清miR-125b表達(dá)水平低于正常對照組(P<0.01)。

2.2 不同時間、轉(zhuǎn)染不同濃度NC mimics、miR-125b mimics的細(xì)胞增殖情況比較 24、48 h時，轉(zhuǎn)染各濃度miR-125b的HCM細(xì)胞相對增殖率均高于轉(zhuǎn)染NC mimics后(P均<0.05)。見表1。

表1 轉(zhuǎn)染不同濃度miR-125b mimics、NC mimics細(xì)胞的增殖情況比較

注：與NC mimics比較，△P<0.01，*P<0.05。

2.3 轉(zhuǎn)染NC mimics、miR-125b mimics的細(xì)胞早期凋亡情況比較 空白組、轉(zhuǎn)染NC mimics終濃度100 nmol/L、miR-125b mimics終濃度50 nmol/L、miR-125b mimics終濃度100 nmol/L細(xì)胞的凋亡百分比分別為12.98%±1.42%、11.56%±1.27%、2.06%±0.33%、3.10%±0.23%，轉(zhuǎn)染50、100 nmol/L miR-125b mimics后HCM細(xì)胞的早期凋亡百分比均低于轉(zhuǎn)染NC mimics后(P<0.05或0.01)。見圖1。

2.4 轉(zhuǎn)染miR-125b后NLRP3、IL-1β、CCL2、CX3CL1、RGC32蛋白表達(dá)比較 轉(zhuǎn)染miR-125b mimics 200 nmol/L后HCM細(xì)胞內(nèi)NLRP3、IL-1β、CCL2、CX3CL1、RGC32的表達(dá)量均較NC mimics組降低(P<0.05)，見表2、圖2。

2.5 雙熒光素酶報告分析結(jié)果 相比于NC mimics組，pMIRREPORTER -NLRP3WT-luc和 miR-125b mimics共轉(zhuǎn)染明顯降低NLRP3的3′UTR區(qū)熒光酶活性(P<0.01)，而pMIR-REPORTER-NLRP3 MUT-luc和miR-125b mimics及NC mimics組共轉(zhuǎn)染均無此作用。結(jié)果表明，miR-125b mimics通過直接靶向作用于NLRP3的3′UTR區(qū)域，抑制HCM細(xì)胞中NLRP3的表達(dá)，見圖3。

3 討論

miRNA是一類長20～24個核苷酸的非編碼小RNA分子，在動植物中廣泛存在，通過特異性作用于靶基因，導(dǎo)致靶基因沉默或降解，參與機(jī)體內(nèi)多種病理、生理過程[5]。2008年，科學(xué)家在人血漿和血清中檢測到miRNA的存在，并且發(fā)現(xiàn)血循環(huán)miRNA可通過血液運(yùn)送到相關(guān)靶器官，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)而影響機(jī)體的生物學(xué)、病理學(xué)功能[6]。目前，血循環(huán)miRNA在冠狀動脈粥樣硬化及心肌細(xì)胞保護(hù)等方面的作用開始成為學(xué)者重點關(guān)注的方向[7]。

注：A為空白組，B為轉(zhuǎn)染NC mimics 100 nmol/L，C為轉(zhuǎn)染miR-125b mimics 100 nmol/L，D為轉(zhuǎn)染miR-125b mimics 50 nmol/L。

圖1 轉(zhuǎn)染NC mimics、miR-125b mimics的細(xì)胞凋亡情況(流式細(xì)胞術(shù))

注：與空白組比較，*P<0.05，△P<0.01。

圖2 轉(zhuǎn)染miR-125b后NLRP3、IL-1β、CCL2、CX3CL1、RGC32蛋白表達(dá)情況(Western blotting法)

注：與NC mimics組相比，**P<0.01。

圖3 雙熒光素酶活性檢測

2009年，研究人員首次在大鼠AMI模型中發(fā)現(xiàn)miR-206顯著高表達(dá)，并與AMI進(jìn)展存在一定的相關(guān)性[8]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA對AMI大鼠有正面調(diào)節(jié)作用，其中miR-98、miR-29、miR-1可有效增強(qiáng)心肌纖維化的收縮力[9]。急性非ST段抬高性心肌梗死(NSTEMI)患者血漿miR-1、miR-21、miR-423-5p、miR-133a表達(dá)量均上升3～5倍，提示miRNA表達(dá)譜與AMI疾病進(jìn)展具有潛在的相關(guān)性[10]。同期，研究人員從相關(guān)文獻(xiàn)中檢索出119種AMI特異性miRNA，通過Targetscan靶點及GO功能分析，表明這些miRNA參與心血管疾病的發(fā)病過程，其中，miR-106b和miR-15b可分別作為AMI中血管凋亡和再生的調(diào)節(jié)因子[11]。生物信息分析人員通過二代測序技術(shù)分析了50例AMI患者的miRNA差異表達(dá)譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-146a、miR-150、miR-155在AMI患者體內(nèi)存在差異表達(dá)，其中miR-146a 50%在人心臟中表達(dá)，表明miRNA在不同組織中表達(dá)存在顯著差異性[12]。

研究表明，miR-125b在心臟組織中表達(dá)較為豐富，與心肌細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生物學(xué)過程密切相關(guān)[13]。miR-125b表達(dá)水平與心肌缺血心臟恢復(fù)能力呈正相關(guān)關(guān)系，缺血后適應(yīng)處理后miR-125b水平均不同程度增高，提示miR-125b可能參與心肌缺血恢復(fù)過程[14]。同時，miR-125b在AMI患者血清表達(dá)豐度均不同程度下降，并且在AMI動物模型中也得到了證實，提示miR-125b可能與AMI的發(fā)病進(jìn)展密切相關(guān)[15]。本研究結(jié)果顯示，相對于健康對照組，miR-125b在AMI組患者血清中表達(dá)水平顯著降低，提示miR-125b可能與AMI后心肌細(xì)胞的功能保護(hù)與恢復(fù)相關(guān)；轉(zhuǎn)染各濃度miR-125b的HCM細(xì)胞的相對增殖率均高于轉(zhuǎn)染NC mimics后，表明轉(zhuǎn)染miRNA-125b可促進(jìn)HCM細(xì)胞的增殖，抑制HCM細(xì)胞凋亡，從而起到心肌細(xì)胞保護(hù)作用。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明，動脈粥樣硬化、脂類代謝紊亂、免疫功能失衡是導(dǎo)致AMI的主要因素，相關(guān)免疫細(xì)胞的分化與增殖可調(diào)控AMI疾病的進(jìn)展[16]。作為模式識別受體家族的重要組成部分，NLRP3炎癥小體在天然免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，與AMI的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。NLRP3炎癥小體的活化可導(dǎo)致機(jī)體炎癥反應(yīng)激活與起始，炎癥性的Ly-6Chigh單核細(xì)胞是AMI最早反應(yīng)的免疫細(xì)胞，心肌缺血受損后特異性表達(dá)趨化因子CX3CL1、CCL2，進(jìn)而促進(jìn)單核細(xì)胞分泌VEGF和TGF-β，加速心肌HCM細(xì)胞修復(fù)[17]。VEGF、TGF-β、皮質(zhì)激素、黃體生成素同時誘導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)因子補(bǔ)體應(yīng)答基因RGC32的表達(dá)，后者廣泛參與腫瘤增殖、分化、炎癥、轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)過程。研究顯示，RGC32在心臟缺血后心肌重塑過程表達(dá)顯著上調(diào)，但目前關(guān)于RGC32對心肌梗死心肌細(xì)胞的影響及機(jī)制尚不清楚[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-125b mimics后HCM細(xì)胞內(nèi)NLRP3、IL-1β、CCL2、CX3CL1、RGC32的表達(dá)量較轉(zhuǎn)染NC mimics后明顯降低，表明miR-125b可抑制HCM細(xì)胞中免疫、炎癥調(diào)節(jié)因子的激活，減輕心肌炎癥性損傷。

綜上所述，AMI患者血清miRNA-125b表達(dá)量顯著降低，同時miRNA-125b可促進(jìn)HCM細(xì)胞的增殖，同時可抑制HCM細(xì)胞凋亡，雙熒光素酶實驗驗證了miR-125b 可直接靶向作用于NLRP3，并且miR-125b可顯著抑制HCM細(xì)胞中免疫、炎癥調(diào)節(jié)因子NLRP3、IL-1β、CCL2、CX3CL1、RGC32蛋白的表達(dá)，從而抑制NLRP3/IL-1β通路激活，從而起到保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。