李海平 盧家吉

自噬是細(xì)胞降解被損害細(xì)胞器及蛋白質(zhì)的過程，其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮著雙重作用，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要的角色[1-3]。但細(xì)胞自噬過程受一系列基因的嚴(yán)格調(diào)控，其中自噬分子Beclin-1是腫瘤細(xì)胞凋亡、分化及腫瘤細(xì)胞自噬間的橋梁，也是參與調(diào)控自噬體形成的關(guān)鍵因子，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中必不可少[4-5]；自噬分子p62可使靶蛋白泛素化，并隨著降解產(chǎn)物包裹人自噬泡而被降解，是自噬的重要標(biāo)志，即p62可通過自噬被降解，其表達(dá)增強則自噬受抑[6-7]。目前有關(guān)自噬分子p62、Beclin1在結(jié)腸癌方面的研究尚不多見，因此本研究旨在探究結(jié)腸癌組織中p62、Beclin1蛋白表達(dá)情況，分析其與結(jié)腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

選取2016年9月至2018年3月于本院住院治療的73例結(jié)腸癌患者為研究對象，搜集其臨床資料并進(jìn)行回顧性分析。所有患者均經(jīng)病理學(xué)診斷確診并行結(jié)腸癌根治術(shù)治療，臨床資料完整，預(yù)計生存期1年以上，手術(shù)情況及隨訪記錄清晰，術(shù)前未接受過任何抗腫瘤治療。73例患者中男性40例，女性33例；年齡33～82歲，平均(56.42±5.03)歲。采集所有患者結(jié)腸癌病理組織標(biāo)本73例，另隨機(jī)選取35例患者并采集距腫瘤組織至少6 cm處的正常癌旁結(jié)腸組織。

1.2 主要試劑及儀器

鼠抗人p62、Beclin1多克隆抗體(英國Abcam公司)，免疫組化試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)等；CUT4062型石蠟切片機(jī)(德國SLEE公司)，YD-A型生物組織攤片機(jī)(德國Lecia公司)，CKX41-A32RC型倒置顯微鏡(日本Olympus公司)等。

1.3 實驗方法

常規(guī)制備石蠟組織切片，厚度約4 μm，經(jīng)脫蠟，水化，3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶處理后，以山羊血清封閉2 h，常溫下復(fù)溫，滴加鼠抗人p62、Beclin1多克隆抗體(濃度1∶100)，37 ℃下孵育30 min，經(jīng)PBS洗滌；滴加廣譜通用型非生物素化IgG，37 ℃下孵育20 min，經(jīng)PBS洗滌；滴加DAB染色液，顯微鏡下控制顯色反應(yīng)時間；然后經(jīng)蘇木精復(fù)染2 min，梯度酒精脫水，自然晾干后，以中性樹膠封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察各組織標(biāo)本中p62、Beclin1蛋白表達(dá)情況。

1.4 染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

p62、Beclin1蛋白陽性著色均以細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色為準(zhǔn)，以半定量積分法判定染色結(jié)果：隨機(jī)選取5個視野，于高倍鏡下對各個視野中的陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行評分，未見陽性細(xì)胞為陰性計0分；陽性細(xì)胞百分比≤10%計1分；陽性細(xì)胞百分比>10%～50%計2分；陽性細(xì)胞百分比>50%～75%計3分；陽性細(xì)胞百分比>75%計4分。另據(jù)染色強度進(jìn)行評分：未見著色計0分；淺黃色計1分；棕黃色計2分；棕褐色計3分。染色總評分=陽性細(xì)胞數(shù)評分×陽性染色強度評分。若染色總評分為0～4分，則為陰性；若染色總評分≥4分，則為陽性[8]。

1.5 觀察指標(biāo)

(1)觀察各組標(biāo)本組織中p62、Beclin1蛋白表達(dá)情況，統(tǒng)計并比較各組織標(biāo)本中p62、Beclin1蛋白陽性表達(dá)率；(2)統(tǒng)計并比較p62、Beclin1蛋白陽性表達(dá)患者相關(guān)臨床病理特征，分析其與p62、Beclin1蛋白表達(dá)的關(guān)系。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，p62、Beclin1蛋白陽性表達(dá)率均以百分比(%)表示，組間比較采用χ2檢驗；雙向有序等級資料采用Spearman秩相關(guān)檢驗；以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌組織及癌旁正常組織p62、Beclin1蛋白表達(dá)情況比較

免疫組化染色顯示，陽性著色呈現(xiàn)棕黃色或棕褐色，且Beclin1蛋白陽性表達(dá)主要分布于細(xì)胞質(zhì)，p62蛋白陽性表達(dá)主要分布于細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)。

結(jié)腸癌組織及癌旁正常組織p62蛋白陽性表達(dá)率分別為12.33%、28.57%，Beclin1蛋白陽性表達(dá)率分別為72.60%、31.43%。結(jié)腸癌組織p62蛋白陽性表達(dá)率顯著低于癌旁正常組織(P<0.05)，Beclin1蛋白陽性表達(dá)率顯著高于癌旁正常組織(P<0.01)。見表1。

表1 結(jié)腸癌組織及癌旁正常組織中p62、Beclin1蛋白陽性表達(dá)率比較(例，%)

2.2 結(jié)腸癌組織中p62、Beclin1蛋白表達(dá)相關(guān)性分析

Spearman秩相關(guān)檢驗結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中p62蛋白及Beclin1蛋白陽性表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(γ=-0.473，P=0.002)。見表2。

2.3 結(jié)腸癌組織中p62、Beclin1蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期患者Beclin1蛋白陽性率高于Ⅲ期患者；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者Beclin1蛋白陽性率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(P<0.05)；而不同臨床病理特征結(jié)腸癌患者病理組織中p62蛋白陽性表達(dá)率均無顯著性差異(P>0.05)。見表3。

表2 結(jié)腸癌組織中p62、Beclin1蛋白表達(dá)相關(guān)性分析(例，%)

表3 結(jié)腸癌組織中p62、Beclin1蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系(例，%)

3 討論

腫瘤細(xì)胞多伴有自噬活性異常，在腫瘤發(fā)生早期，細(xì)胞自噬功能缺失可導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，促進(jìn)腫瘤發(fā)生與生長；而在腫瘤晚期，隨著腫瘤體積的不斷增大，細(xì)胞處于缺氧及營養(yǎng)匱乏狀態(tài)，自噬激活作為一種生存機(jī)制維持腫瘤細(xì)胞在不利環(huán)境中存活，促進(jìn)腫瘤生長，表現(xiàn)出時間上的雙重性[9-10]。因此細(xì)胞自噬與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，推測結(jié)腸癌細(xì)胞自噬能力變化對其進(jìn)展也具有重要意義，本研究旨在深入探究自噬相關(guān)分子Beclin-1、p62蛋白在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)情況，并分析其與結(jié)腸癌患者臨床病理特征間的相關(guān)性。

Beclin1是首個被鑒定為介導(dǎo)哺乳動物自噬的基因，是啟動細(xì)胞自噬過程的標(biāo)志分子，其缺失或突變時將明顯降低細(xì)胞死亡能力，促進(jìn)細(xì)胞惡變增殖，削弱自噬，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[11-12]。祁璘等[13]研究報道，Beclin1蛋白在一些腫瘤細(xì)胞如直腸癌、宮頸癌細(xì)胞中高表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞保持較高的自噬活性。p62蛋白也是一種典型的自噬相關(guān)蛋白，其可結(jié)合泛素化蛋白，與LC3蛋白形成復(fù)合體，導(dǎo)致蛋白轉(zhuǎn)入自噬溶酶體內(nèi)被降解，自噬發(fā)生時，隨著蛋白不斷降解，p62蛋白含量逐漸降低，其也是檢測自噬活性的標(biāo)志蛋白之一[14-15]。王淅鳳[16]研究報道，p62蛋白作為細(xì)胞自噬調(diào)控過程中的一種可選擇底物，其累積提示自噬能力衰退，而當(dāng)自噬受抑時，作為監(jiān)測及參與細(xì)胞自噬啟動的主要因子Beclin1蛋白表達(dá)則會降低，提示自噬相關(guān)分子Beclin1與p62蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中Beclin1蛋白陽性表達(dá)率顯著高于癌旁正常結(jié)腸組織，p62蛋白陽性表達(dá)率顯著低于癌旁正常組織；此外，Spearman秩相關(guān)檢驗結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中p62蛋白及Beclin1蛋白陽性表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，因此Beclin1蛋白與p62蛋白可作為結(jié)腸癌治療的潛在靶向分子。本研究還對Beclin1、p62蛋白陽性表達(dá)情況與結(jié)腸癌患者臨床病理特征進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示Beclin1蛋白陽性表達(dá)與結(jié)腸癌患者TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。而p62蛋白陽性表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床病理特征無顯著相關(guān)性，可能與本研究樣本量少、檢測方法單一等有關(guān)，因此仍需進(jìn)一步加大樣本量，采用多種檢測手段重復(fù)實驗以確認(rèn)Beclin蛋白及p62蛋白陽性表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床病理特征間的關(guān)系。

綜上，結(jié)腸癌組織中Beclin1蛋白高表達(dá)而p62蛋白低表達(dá)，且Beclin1蛋白陽性表達(dá)與患者TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而p62蛋白陽性表達(dá)與患者臨床病理特征無明顯相關(guān)性。