童 薇 張 敬 朱艷麗 雍 翔

食管癌屬于1種消化道惡性腫瘤，在臨床極為常見。在我國，食管癌具有較高的發(fā)病率及死亡率[1]。近年來，相關(guān)醫(yī)學(xué)研究表明[2]，在惡性腫瘤中，食管癌發(fā)病率位居第五位，死亡率位居第四位，僅次于肺癌、肝癌、胃癌。要想有效治療食管癌，對患者預(yù)后進行改善，就應(yīng)該將能夠?qū)⑹彻馨┌l(fā)生發(fā)展及預(yù)后特征性反映出來的分子生物學(xué)指標(biāo)尋找出來。本研究探討了食管鱗癌中STC2、MMP-9及PCNA表達情況。

1 材料與方法

1.1 一般資料

隨機選取2016年4月至2019年4月我院食管鱗癌患者80例，其中男性50例，女性30例，年齡46～80歲，平均(63±5.0)歲。另選取癌旁1～3 cm處組織40例，對應(yīng)癌瘤灶旁5 cm以外處上下殘端正常食管粘膜組織40例。

1.2 實驗材料

購買Proteintech公司生產(chǎn)的STC2抗體稀釋1∶50，北京中杉金橋公司生產(chǎn)的MMP-9、PCNA一抗稀釋1∶100，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒、PV-6001、6002免疫組化試劑盒，PBS磷酸鹽緩沖液，日本奧林巴斯BX41顯微鏡，德國2035石蠟切片機。

1.3 方法

應(yīng)用免疫組織化學(xué)二步法，用切片機連續(xù)切片組織蠟塊，切片厚度為4 μm左右。然后漂片，之后攤片，最后烤片。在二甲苯Ⅰ中放置切片10 min，在二甲苯Ⅱ中放置切片10 min，在無水酒精Ⅰ中放置切片3 min，在無水酒精Ⅱ中放置切片3 min，在90%酒精中放置切片3 min，在80%酒精中放置切片3 min，在70%酒精中放置切片3 min，脫蠟至水。在3%過氧化氫去離子水中進行15 min的孵育，將內(nèi)源性過氧化物酶阻斷，PBS沖洗。在高壓鍋中放置，對抗原進行高壓修復(fù)，壓力閥噴氣后計時2 min，然后自然冷卻到室溫，PBS浸洗。將兔抗人STC2抗體、MMP-9抗體、鼠抗人PCNA抗體滴加到三組切片中，在室溫下進行1～1.5 h的孵育，然后在4 ℃的溫度下過夜。第2 d用PBS進行5 min浸洗，共3次。將PV-6001滴加到STC2、MMP-9中，將PV-6002滴加到PCNA中，在37 ℃的溫度下進行1 h的孵育，PBS進行5 min浸洗，共3次。將DNA滴加其中進行2～3 min顯色，沖洗過程中將蒸餾水充分利用起來，將染色終止。蘇木精復(fù)染3 min，過水。鹽酸酒精一過、氨水3 min，過水。80%酒精5 min，90%酒精5 min，無水酒精Ⅰ5min，無水酒精Ⅱ5 min，透明，封片過程中將中性樹膠充分利用起來。將說明書推薦組織切片設(shè)定為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 觀察指標(biāo)

顯微鏡下對腫瘤細胞陽性率進行評定，將5個區(qū)域隨機選取出來，×400倍光鏡下對腫瘤組織中的陽性細胞數(shù)進行計數(shù)，最終將平均值計算出來。STC2陽性染色顆粒在細胞質(zhì)中分布，呈棕黃色，陽性腫瘤細胞率0～10%、11%～50%、51%～75%、76%～100%分別評定為0、1、2、3。腫瘤細胞無著色、淡黃色、黃色、棕黃色分別評定為0、1、2、3。染色陽性細胞率×染色強度=染色指數(shù)，<4、≥4分別評定為陰性、陽性[3]。MMP-9陽性信號為抗體有棕黃色顆粒出現(xiàn)在細胞質(zhì)中，將5個高倍視野(×400)從每張切片中隨機選取出來觀察，陽性細胞數(shù)<10%、≥10%分別評定為陰性表達、陽性表達[4]。PCNA陽性染色顆粒在細胞核中分布，呈棕黃色，將各例標(biāo)本陽性細胞百分率計算出來，分為四級，0～25%、25%～50%、51%～75%、76%～100%分別評定為Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級、Ⅳ級。無陽性反應(yīng)、Ⅰ～Ⅳ級分別評定為陰性、陽性[5]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

計數(shù)資料用率表示，應(yīng)用χ2檢驗。用COX回歸分析進行多因素分析，應(yīng)用SPSS 21.0軟件分析，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同組織中STC2、MMP-9及PCNA表達情況比較

食管鱗癌組織中STC2、MMP-9及PCNA表達陽性率均顯著高于食管癌旁、正常食管粘膜組織(P<0.05)，食管癌旁組織中STC2、MMP-9表達陽性率均顯著高于正常食管粘膜組織(P<0.05)，但食管癌旁、正常食管粘膜組織中PCNA表達陽性率的差異不顯著(P>0.05)，見表1。

表1 不同組織中STC2、MMP-9及PCNA表達情況比較(例，%)

2.2 食管鱗癌患者STC2、MMP-9及PCNA表達與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性分析

食管鱗癌患者病理分期Ⅲ～Ⅳ期、組織學(xué)分級低分化、有淋巴管浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的STC2、MMP-9及PCNA表達陽性率顯著高于病理分期Ⅰ～Ⅱ期、病組織學(xué)分級中高分化、無淋巴管浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(P<0.05)，但不同性別、年齡、病變長度、病變直徑、腫瘤部位患者的STC2表達陽性率之間的差異均不顯著(P>0.05)。具體見表2。

3 討論

斯鈣素2(STC 2)屬于1種糖蛋白激素，在腎臟、腸的鈣磷運輸、細胞內(nèi)鈣磷平衡中參與。近年來，相關(guān)醫(yī)學(xué)研究表明[6]，乳腺癌、胃癌、喉癌等多種腫瘤組織中具有較高的STC 2表達，同時，腫瘤生長、侵襲等均和STC 2關(guān)系密切。相關(guān)醫(yī)學(xué)研究表明[7-9]，STC 2在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中和腫瘤組織適應(yīng)低氧環(huán)境相關(guān)，同時在腫瘤細胞增殖中參與，通過血管生成素(Ang-2)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)為腫瘤組織血管生成提供良好的前提條件，促進腫瘤侵襲性的增加，為淋巴細胞轉(zhuǎn)移提供良好的前提條件。相關(guān)醫(yī)學(xué)學(xué)者研究了食管癌中的STC 2[10-11]，結(jié)果表明，腫瘤增殖、侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移均和STC 2關(guān)系密切，同時，食管癌預(yù)后也和STC 2關(guān)系密切?；|(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)屬于1種Ⅳ型膠原酶，能夠?qū)毎饣|(zhì)的合成、降解代謝進行調(diào)節(jié)，進而對細胞和細胞間、細胞和基質(zhì)間的信號傳遞造成影響，從而對細胞分化、遷移、組織重塑等進行調(diào)節(jié)，為腫瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移提供良好的前提條件。MMP-9能夠表達于腫瘤細胞、成纖維細胞等多種細胞中。增殖細胞核抗原(PCNA)是DNA聚合酶的輔助蛋白，在細胞核中有兩種PCNA存在，1種具有可溶性，另1種具有不溶性，其中可溶性PCNA表達于細胞周期各期中，在DNA合成過程中，其表達量變化不顯著；不溶性PCNA具有較高的穩(wěn)定性，不顯著表達于G0～G1期細胞中，大幅度表達于G1晚期細胞中，達到高峰在S期細胞中，顯著降低在G2-M期細胞中，DNA合成和其表達量一致，對其在細胞中的表達進行檢測能夠?qū)⒂行б罁?jù)提供給臨床對細胞增殖狀態(tài)的評定工作。

表2 食管鱗癌患者STC2、MMP-9及PCNA表達與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性分析(例，%)

腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移和STC2、MMP-9關(guān)系密切，腫瘤細胞增殖和PCNA關(guān)系密切。但是現(xiàn)階段，還較少有相關(guān)醫(yī)學(xué)研究報道上述3個指標(biāo)聯(lián)合檢測在食管癌組織中的意義。相關(guān)醫(yī)學(xué)研究表明[12-15]，和癌旁組織、正常食管粘膜組織相比，食管癌組織中具有顯著較高的STC2、MMP-9及PCNA表達，病理分期、低分化、淋巴管浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均和其關(guān)系密切。在食管癌患者預(yù)后的影響因素中，STC2是獨立因素，如果患者具有較高的STC2、MMP-9及PCNA表達，那么其就會具有較差的生存預(yù)后，而如果患者同時具有較高的STC2、MMP-9及PCNA表達，那么其就會具有更差的生存預(yù)后。本研究結(jié)果表明，食管鱗癌組織中STC2、MMP-9及PCNA表達陽性率均顯著高于食管癌旁、正常食管粘膜組織，食管癌旁組織中STC2、MMP-9表達陽性率均顯著高于正常食管粘膜組織，但食管癌旁、正常食管粘膜組織中PCNA表達陽性率之間的差異不顯著。食管鱗癌患者病理分期Ⅲ～Ⅳ期、組織學(xué)分級低分化、有淋巴管浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的STC2、MMP-9及PCNA表達陽性率顯著高于病理分期Ⅰ～Ⅱ期、病組織學(xué)分級中高分化、無淋巴管浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，但不同性別、年齡、病變長度、病變直徑、腫瘤部位患者的STC2表達陽性率之間的差異均不顯著，和上述相關(guān)醫(yī)學(xué)研究結(jié)果一致。

總之，食管鱗癌中STC2、MMP-9及PCNA表達陽性率均顯著提升，與病理分期、組織學(xué)分級、淋巴管浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，值得重視。