余 璐 文 燕 湯俊起

口腔鱗狀細(xì)胞癌是存在于口腔黏膜上皮的鱗狀細(xì)胞癌，它能早期經(jīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移至其他組織器官，有煙酒嗜好的中年人群多發(fā)[1]?？谇击[癌的預(yù)后較差，一般采用手術(shù)切除作為常用的治療手段，但是手術(shù)的問(wèn)題在于嚴(yán)重影響患者的面部美觀[2-3]。驅(qū)動(dòng)蛋白(kinesin)在膜性細(xì)胞器的運(yùn)輸，有絲分裂、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、mRNA和蛋白質(zhì)的運(yùn)輸?shù)确矫嫫鹬匾饔肹4-5]。驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員KIF11作用于早期的有絲分裂，在染色體的分離起著很重要的作用，和細(xì)胞增殖有相關(guān)性[6]。RhoA屬于小G蛋白的Ras超家族成員，廣泛參與肌動(dòng)蛋白的細(xì)胞骨架重組、細(xì)胞黏附、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等涉及腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的各個(gè)環(huán)節(jié)的調(diào)控[7]。Fascin蛋白是肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，對(duì)細(xì)胞移動(dòng)起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)Fascin蛋白在多種腫瘤組織和癌前病變組織中呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)。有研究顯示Fascin蛋白對(duì)腫瘤早期診斷、預(yù)后判定、輔助治療選擇具有重要意義[8-9]。

本研究通過(guò)檢測(cè)KIF11、RhoA和Fascin蛋白在口腔鱗癌中的表達(dá)及與口腔鱗癌臨床病理特征的關(guān)系，為口腔鱗癌的預(yù)后判斷及臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2016年2月至2018年2月我院保存的口腔鱗癌蠟塊組織標(biāo)本70例，其中，男性40例，女性30例；年齡40～73歲，中位年齡61歲。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者29例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者41例；病理分級(jí)參照WHO口腔鱗癌分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，高分化32例，中分化28例，低分化10例；TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，T1期11例，T2期24例，T3期20例，T4例15例?；颊呒{入標(biāo)準(zhǔn)：①病理確診為口腔鱗癌；②在手術(shù)前沒有接受過(guò)放療和化療等；③臨床資料相對(duì)完整。排除合并其他原發(fā)性惡性腫瘤的患者。選取相同組織標(biāo)本距癌組織>2 cm的癌旁組織作為對(duì)照，經(jīng)病理性確認(rèn)切緣為陰性。

1.2 主要試劑

Trizol試劑(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)；甲紫溶液(廣東恒健制藥有限公司)；無(wú)酶的RNA沖洗液(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)；免疫熒光制劑(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)。鼠抗人KIF11單克隆抗體、鼠抗人RhoA單克隆抗體和鼠抗人Fascin單克隆抗體(美國(guó)Abcam公司)；生物素-鏈霉卵白素免疫組化檢測(cè)試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

切片脫蠟水化，3%H2O2甲醇滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，依次滴加一抗(稀釋比例均為1∶300)、二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片。用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對(duì)照。

1.4 RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄

使用TRIzol試劑對(duì)組織RNA進(jìn)行提取，按照操作試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物榮譽(yù)DEPC水中，保存于-20 ℃冰箱中待用。

1.5 PCR擴(kuò)增及電泳

吸取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5 μl進(jìn)行PCR擴(kuò)增，GAPDH作為內(nèi)參物，引物由Invitrogen公司合成，其序列表見表1。KIF11、RhoA和Fascin擴(kuò)增條件為：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，59 ℃ 40 s，72 ℃ 45 s，循環(huán)次數(shù)40次。取PCR反應(yīng)后產(chǎn)物適量進(jìn)行凝膠電泳(120 V，35 min)。最后進(jìn)行電泳條帶灰度值的半定量分析，重復(fù)5次，mRNA的相對(duì)表達(dá)量使用目的與內(nèi)參條帶的灰度值比值。

表1 RT-PCR引物序列

1.6 結(jié)果判斷

病理結(jié)果顯示KIF11、RhoA和Fascin定位于上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和(或)胞核，陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)為出現(xiàn)棕黃色顆粒。隨機(jī)選取5個(gè)視野，著色細(xì)胞比例≤25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分；染色強(qiáng)度無(wú)著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕褐色為3分。最終得分為著色細(xì)胞比例和染色強(qiáng)度評(píng)分相乘，積<4分為陰性，≥4分為陽(yáng)性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)處理應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行，計(jì)數(shù)資料的比較，使用χ2檢驗(yàn)，采用Spearman 相關(guān)分析法用于相關(guān)性的分析。P<0.05為差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 KIF11、RhoA和Fascin蛋白在癌組織及癌旁組織中的陽(yáng)性率比較

KIF11主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，KIF11在口腔鱗癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為68.57%，而癌旁組織中KIF11的陽(yáng)性表達(dá)率為7.14%，顯著低于癌組織(P<0.05)；RhoA主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，少量表達(dá)于細(xì)胞核，癌組織中RhoA陽(yáng)性表達(dá)率為60.00%，而癌旁組織中RhoA陽(yáng)性表達(dá)率為11.43%，顯著低于癌組織(P<0.05)；Fascin主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，癌組織中Fascin陽(yáng)性表達(dá)率為64.29%，而癌旁組織中Fascin陽(yáng)性表達(dá)率為12.86%，顯著低于癌組織(P<0.05)，見表2。

表2 KIF11、RhoA和Fascin蛋白在癌組織及癌旁組織中陽(yáng)性率比較(例，%)

2.2 KIF11、RhoA和Fascin mRNA表達(dá)水平比較

結(jié)果顯示，KIF11、RhoA和Fascin mRNA在口腔鱗癌組織中的相對(duì)表達(dá)量分別為0.125±0.067，0.108±0.052和0.116±0.061，明顯高于三者在癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)量0.011±0.006，0.034±0.013和0.021±0.009，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 KIF11、RhoA和Fascin mRNA表達(dá)水平比較

2.3 KIF11、RhoA和Fascin蛋白表達(dá)與口腔鱗癌臨床特征的關(guān)系

KIF11、RhoA和Fascin蛋白表達(dá)與口腔鱗癌分化程度、頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及腫瘤直徑有關(guān)(P<0.05)，與年齡和性別無(wú)相關(guān)性(P>0.05)，見表4。

表4 KIF11、RhoA和Fascin mRNA表達(dá)水平與口腔鱗癌臨床特征的關(guān)系(例，%)

2.4 相關(guān)性分析

Spearman 相關(guān)分析顯示，KIF11蛋白與RhoA蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(γ=0.479，P<0.05)，F(xiàn)ascin與RhoA蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(γ=0.521，P<0.05)。

3 討論

目前口腔鱗癌的病因和發(fā)病機(jī)制仍不清楚，但是越來(lái)越多的腫瘤標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)，可用于口腔鱗癌的診斷，治療和預(yù)后[10-11]。KIF11主要與細(xì)胞分裂中雙極紡錘體的形成和分離以及中心體的分離有關(guān)。KIF11在大多數(shù)口腔癌細(xì)胞和組織中都有表達(dá)，但在健康的舌組織中幾乎沒有檢測(cè)到。有研究發(fā)現(xiàn)抑制KIF11的表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，KIF11在口腔鱗癌中的生長(zhǎng)和生存中起關(guān)鍵作用，可以成為口腔鱗癌的診斷、治療和預(yù)后因素[12]，但相關(guān)研究較少。本研究中癌組織中KIF11的陽(yáng)性表達(dá)率為68.57%，顯著低于癌旁組織中KIF11的陽(yáng)性表達(dá)率7.14%(P<0.05)，KIF11 mRNA在口腔鱗癌組織中的相對(duì)表達(dá)量分別為(0.125±0.067)，顯著高于癌旁組織(0.011±0.006)(P<0.05)。結(jié)果提示KIF11可作為口腔鱗癌診斷的標(biāo)志性蛋白。另外KIF11蛋白陽(yáng)性表達(dá)與口腔鱗癌分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，結(jié)果顯示KIF11蛋白陽(yáng)性表達(dá)率越高，腫瘤的惡性程度越高，但是其與年齡和性別無(wú)關(guān)(P>0.05)，提示KIF11蛋白可作為判斷口腔鱗癌分化程度等的標(biāo)志性蛋白。Kayo等研究顯示KIF11在99個(gè)口腔癌組織中表達(dá)率為64.6%，但在健康口腔上皮中沒有表達(dá)，KIF11可能是口腔癌的一個(gè)潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，與本研究結(jié)果一致[12]。

RhoA廣泛參與肌動(dòng)蛋白的細(xì)胞骨架重組、細(xì)胞黏附、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等涉及腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的各個(gè)環(huán)節(jié)的調(diào)控，在腫瘤發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中有著重要作用[13]。研究發(fā)現(xiàn)在肝癌、乳腺癌、睪丸癌等惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)RhoA存在異常表達(dá)，其上調(diào)和(或)過(guò)表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)[14]。本研究中癌組織中RhoA蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為60.00%，顯著低于癌旁組織中RhoA的陽(yáng)性表達(dá)率11.43%(P<0.05)；RhoA mRNA在口腔鱗癌組織中的相對(duì)表達(dá)量(0.108±0.052)，顯著高于癌旁組織(0.034±0.013)(P<0.05)。以上結(jié)果提示RhoA蛋白可作為口腔鱗癌診斷的標(biāo)志性蛋白。另外RhoA蛋白陽(yáng)性表達(dá)與口腔鱗癌分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，說(shuō)明RhoA蛋白陽(yáng)性表達(dá)率越高，口腔鱗癌的惡性程度越高，但是其與年齡和性別無(wú)關(guān)(P>0.05)，提示RhoA蛋白可作為判斷口腔鱗癌分化程度等的標(biāo)志性蛋白。王瑩等研究發(fā)現(xiàn)RhoA在口腔鱗癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為80.0%，作者推測(cè)RhoA可能與口腔癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[15]。此結(jié)果與本研究結(jié)果相一致。

Fascin蛋白活性與癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞的轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系[8]。研究發(fā)現(xiàn)隨著Fascin基因表達(dá)的增加，細(xì)胞分化程度降低，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性和侵襲能力均增強(qiáng)[16]。另有研究發(fā)現(xiàn)隨著腫瘤浸潤(rùn)能力的增強(qiáng)，F(xiàn)ascin蛋白的數(shù)量會(huì)增多，說(shuō)明其在口腔鱗癌在腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用[9]。本研究中口腔鱗癌組織中Fascin的陽(yáng)性表達(dá)率為64.29%，顯著低于癌旁組織中Fascin的陽(yáng)性表達(dá)率12.86%(P<0.05)；Fascin mRNA在口腔鱗癌組織中的相對(duì)表達(dá)量(0.116±0.061)，顯著高于癌旁組織(0.021±0.009)(P<0.05)。以上結(jié)果提示Fascin蛋白可作為口腔鱗癌診斷的標(biāo)志性蛋白。另外Fascin蛋白陽(yáng)性表達(dá)與與口腔鱗癌分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，說(shuō)明Fascin蛋白陽(yáng)性表達(dá)率越高，腫瘤的惡性程度越高，但是其與年齡和性別無(wú)關(guān)(P>0.05)，提示Fascin蛋白可作為判斷口腔鱗癌分化程度等的標(biāo)志性蛋白。

以往研究顯示KIF驅(qū)動(dòng)蛋白可以改變RhoA GTP酶信號(hào)，當(dāng)KIF驅(qū)動(dòng)蛋白缺失時(shí)細(xì)胞中的RhoA活性下降[17]。另外Jayo等發(fā)現(xiàn)Fascin-1是Rho的功能靶點(diǎn)，Rho也能調(diào)節(jié)Fascin-1和肌動(dòng)蛋白的相互作用[18]。本研究顯示口腔鱗癌患者中KIF11和Fascin的表達(dá)均與RhoA呈顯著正相關(guān)，結(jié)果提示KIF11、Fascin和RhoA之間存在相互影響的關(guān)系，可能共同參與了口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，KIF11、RhoA和Fascin蛋白過(guò)表達(dá)與口腔鱗癌的發(fā)生、分化程度等顯著相關(guān)，共同參與了口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展，聯(lián)合檢測(cè)為臨床上口腔鱗癌的診斷及預(yù)后提供了新的參考。