蔡忠璐，段友健*，徐聚臣，何宇，耿介之，劉旋，韓牧軒，柳玉海

(1.大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023； 2.內(nèi)蒙古自治區(qū)赤峰市達(dá)里湖漁場，內(nèi)蒙古 赤峰 024000)

瓦氏雅羅魚Leuciscuswaleckii又稱東北雅羅魚，隸屬于鯉形目鯉科雅羅魚亞科雅羅魚屬，主要分布于黑龍江水系、松花江水系及鴨綠江、圖們江等水域，其中達(dá)里湖分布數(shù)量最多。達(dá)里湖地處內(nèi)蒙古自治區(qū)赤峰市，湖面面積190 km2，湖面海拔1226～1228 m，有亮子河、沙里河、耗來河和貢格爾河四條河流匯入[1]。近40年來，平均氣溫顯著升高，蒸發(fā)量遠(yuǎn)大于補(bǔ)充量使得湖水面積減少約40 km2[1]，使之成為獨(dú)特的高礦化度、高堿度碳酸型鹽水湖[2]，極端的水文情況使得湖中僅有瓦氏雅羅魚和鯽兩種經(jīng)濟(jì)魚類[3]。近年來，達(dá)里湖水質(zhì)進(jìn)一步惡化，為了保護(hù)其種質(zhì)資源，有必要對(duì)達(dá)里湖瓦氏雅羅魚群體基礎(chǔ)生物學(xué)進(jìn)行深入調(diào)查。

魚類年齡數(shù)據(jù)的獲取是漁業(yè)科學(xué)的主要研究內(nèi)容，與年齡結(jié)構(gòu)信息、生長率、死亡率等魚類種群統(tǒng)計(jì)學(xué)參數(shù)直接相關(guān)，其推動(dòng)著魚類年齡鑒定的進(jìn)步[4]。目前，鑒定魚類年齡尤其是高齡魚類，普遍采用的方法是鈣化組織年輪計(jì)數(shù)法[4-5]。黑龍江水系瓦氏雅羅魚年齡較低，很多學(xué)者利用鱗片鑒定其年齡[6-8]。針對(duì)達(dá)里湖瓦氏雅羅魚年齡較高的特點(diǎn)，解玉浩等[9]認(rèn)為鱗片僅適用于低齡個(gè)體的年齡鑒定。此外，諸多學(xué)者認(rèn)為耳石是鑒定高齡個(gè)體的最佳材料，可以保證高精確度和準(zhǔn)確性[10-12]。但對(duì)于達(dá)里湖瓦氏雅羅魚高齡個(gè)體年齡材料的選擇和幾種年齡材料的比較目前尚未見報(bào)道。本研究中，通過對(duì)達(dá)里湖瓦氏雅羅魚5種主要鈣化組織(耳石、鱗片、脊椎骨、鰓蓋骨、匙骨)年齡鑒定結(jié)果的精確性進(jìn)行比較，篩選出達(dá)里湖瓦氏雅羅魚合適的年齡鑒定材料，旨在為開展達(dá)里湖瓦氏雅羅魚生物學(xué)和生態(tài)學(xué)研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

2017年5、7、9月和2018年1月在內(nèi)蒙古自治區(qū)達(dá)里湖使用三層流刺網(wǎng)(內(nèi)層網(wǎng)目7.5 cm，外層網(wǎng)目18 cm)、地籠(網(wǎng)目1.5 cm)和定置刺網(wǎng)采集瓦氏雅羅魚樣本686尾，對(duì)采集樣本測量全長、體長和體質(zhì)量，長度精確到1 mm，體質(zhì)量精確到0.1 g。

1.2 方法

1.2.1 樣品的采集 從捕獲的瓦氏雅羅魚中采集樣品，耳石樣品采集自217尾魚，鱗片樣品采集自239尾魚，脊椎骨、鰓蓋骨和匙骨采集自236尾魚。將耳石樣品用95%酒精洗凈，經(jīng)自然晾干后放入0.5 mL離心管中保存，鱗片存入鱗片袋保存，脊椎骨、鰓蓋骨和匙骨存入自封袋內(nèi)低溫保存。

1.2.2 樣品的處理 (1)鱗片。取魚體左側(cè)背鰭基部下、側(cè)線鱗以上2～3行鱗片5～8枚，放入4% KOH溶液中浸泡5～10 min，用清水漂洗后晾干，在解剖鏡下觀察并拍照。(2)耳石。瓦氏雅羅魚耳石輪紋在顯微鏡下觀察不清晰，需要打磨處理。將微耳石的凸面向上，使用熱熔膠將其固定于載玻片上。用500#水磨砂紙粗磨后使用1000#和1500#水磨砂紙細(xì)磨，再用拋光紙拋光(3 μm)，并在光學(xué)顯微鏡下觀察。當(dāng)打磨至耳石核心時(shí)，將耳石翻面，使用透明指甲油包埋，繼續(xù)打磨直至耳石核心清晰。(3)脊椎骨。取第4～10節(jié)脊椎骨，在沸水中煮沸2～4 min，用4% KOH溶液浸泡1～2 d，用鑷子和刷子剔除粘連的肌肉和結(jié)締組織，用無水乙醇脫脂，解剖鏡入射光下觀察并拍照。(4)鰓蓋骨和匙骨。取鰓蓋骨和匙骨在沸水中煮沸2～4 min，用4% KOH溶液浸泡1～2 d，剔除黏連的肌肉和結(jié)締組織，待其自然晾干后在60 ℃烘箱內(nèi)烘烤3～4 h，解剖鏡入射光下觀察并拍照。

1.2.3 年齡鑒定 采用吻合率、年齡偏差圖[11]、可判讀力[13]和平均變異系數(shù)(CV)[14]對(duì)年齡材料的差異進(jìn)行比較，平均變異系數(shù)計(jì)算公式如下[7]：

其中：N為年齡鑒定魚尾數(shù)(ind.)；R為每尾魚鑒定年齡的次數(shù)；Xij為第j尾魚進(jìn)行的第i次年齡鑒定結(jié)果(a)；Xj為第j尾魚的平均年齡(a)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用OLYMPUS DP2-BSW數(shù)碼拍照系統(tǒng)拍照，采用Adobe Photoshop CS6軟件處理圖片，采用Microsoft Excel 2010、SPSS 21.0軟件處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 年齡鑒定材料的形態(tài)與年輪特征

2.1.1 耳石 瓦氏雅羅魚微耳石形狀近似馬蹄形，前部膨大且厚實(shí)，后部薄而尖，呈凹型，在核心處有突起，外側(cè)面呈曲線凸起，較為平滑。在入射光下幾乎不透光。經(jīng)水砂紙打磨后的耳石磨片可在顯微鏡下觀察到白色不透明的寬帶和黑色透明的狹窄帶相間排列，可將狹窄帶與寬帶之間視為年輪特征，易于判別(圖1-A)。

2.1.2 脊椎骨 瓦氏雅羅魚脊椎骨呈兩個(gè)相互倒置的圓錐形，前5～10節(jié)椎面較圓，內(nèi)凹不深，易于分離，鈣質(zhì)沉積充足，輪紋清晰，觀察方便。在解剖鏡入射光下觀察，寬窄交替的同心圓環(huán)明顯，濁白色的寬帶與暗色的窄帶組成一個(gè)生長年帶，即濁白色寬帶內(nèi)緣與暗色窄紋外緣交界處為年輪(圖1-B)。

2.1.3 鰓蓋骨和匙骨 瓦氏雅羅魚的鰓蓋骨是近似梯形的不規(guī)則四邊形，基部兩側(cè)一長一短。在入射光下有較淺的V字環(huán)形分布，兩邊分別與外緣平行，可作為年齡鑒定的標(biāo)志。但是多數(shù)年齡標(biāo)志不清晰或沒有，并常伴有干擾輪出現(xiàn)，極易低估年齡(圖1-C)。

瓦氏雅羅魚的匙骨為鐮刀形，上匙骨部分為乳白色尖刺，骨質(zhì)較厚，入射光下觀察年輪特征不明顯，下匙骨部分為V形薄片，在入射光下觀察有較淺的V字環(huán)形分布，兩邊分別與外緣平行，可作為年齡標(biāo)志。但中心較薄，看不到年齡標(biāo)志，極易低估年齡(圖1-D)。

2.1.4 鱗片 瓦氏雅羅魚鱗片的形態(tài)為常見的圓鱗，近似圓形，年輪圍繞鱗焦呈同心圓排列，在鱗片前側(cè)區(qū)有明顯的年輪標(biāo)志。主要為普通切割形和疏密切割形(圖1-E)，未見吸收退化，磨損較少。5齡及以下個(gè)體鱗片年輪標(biāo)志清晰明顯，容易判別。而5齡以上個(gè)體年輪標(biāo)志緊密，特征不清晰，極易導(dǎo)致年齡低估。

2.2 5種年齡材料讀齡的比較分析

輪紋清晰度評(píng)級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：1級(jí)(非常好)，材料輪紋清晰，年齡直觀；2級(jí)(好)，輪紋較為清晰，年齡辨別度較高；3級(jí)(一般)輪紋較為清晰，經(jīng)仔細(xì)確認(rèn)后可以辨別；4級(jí)(差)，輪紋模糊，年齡辨別困難；5級(jí)(不可讀)，輪紋無或十分模糊，無法辨別年齡。依據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)達(dá)理湖瓦氏雅羅魚5種年齡材料輪紋清晰度評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，耳石輪紋的清晰度最高，被判斷為非常好和好的比例在5種年齡鑒定材料中最高，為62.63%，可判讀力為95.57%；其次是脊椎骨，被判斷為非常好和好的比例達(dá)49.11%，可判讀力為89.35%；而鰓蓋骨和匙骨不可讀力均高達(dá)30%以上(表1)，故可排除鰓蓋骨和匙骨作為瓦氏雅羅魚的年齡鑒定材料。

從表2可見：對(duì)同一個(gè)體的年齡解釋不盡相同，耳石磨片的年輪計(jì)數(shù)高于脊椎骨年輪計(jì)數(shù)和鱗片的年輪計(jì)數(shù)；在高齡個(gè)體的年齡鑒定上差異較為明顯，在低齡個(gè)體(2～3齡)的年齡鑒定上相對(duì)一致；耳石磨片鑒定的最高年齡為14齡，脊柱骨鑒定的最高年齡為10齡，鱗片鑒定的最高年齡僅為7齡。在兩次獨(dú)立讀齡中，耳石的兩次年齡讀數(shù)吻合率最高，±0齡吻合率為86.84%，±1齡吻合率為99.47%，平均變異系數(shù)最低，為2.22%；鱗片的讀齡吻合率比耳石低，但在低齡時(shí)與耳石讀齡結(jié)果相差無幾。

鑒于耳石鑒定年齡輪紋清晰，吻合率高，可判讀力高，且可重復(fù)性好，所以將耳石作為年齡鑒定的基準(zhǔn)，比較鱗片、脊椎骨的年齡讀數(shù)(圖2)，結(jié)果顯示，脊椎骨讀齡與耳石讀齡一致性較好，年齡結(jié)果與耳石接近。

表1 瓦氏雅羅魚5種年齡材料清晰度評(píng)分和可判讀力Tab.1 Readable capacity and readability score of five aging materials in Amur ide Leuciscus waleckii %

3 討論

3.1 5種年齡鑒定材料的特點(diǎn)

鱗片、脊椎骨、耳石、鰓蓋骨和匙骨作為常見的年齡鑒定材料在魚類的年齡鑒定中得到廣泛應(yīng)用，但并不是每種年齡材料都能得到有效的年齡讀數(shù)。本研究中，相當(dāng)一部分個(gè)體的匙骨和鰓蓋骨較厚且渾濁，輪紋不清晰或無輪紋形成，這可能與達(dá)里湖瓦氏雅羅魚群體的生境相關(guān)[15]。在5種年齡材料中，鰓蓋骨和匙骨的可判讀力最低，鑒定效果最差，不適用于達(dá)里湖瓦氏雅羅魚的年齡鑒定。

在瓦氏雅羅魚的年齡鑒定中，李國芳等[6]、劉立志等[7]均選用鱗片作為瓦氏雅羅魚年齡鑒定的材料[8]。達(dá)里湖瓦氏雅羅魚與黑龍江、烏蘇里江、嫩江的瓦氏雅羅魚群體有所不同，不但其年齡范圍較之黑龍江水系大[9]，而且由于達(dá)里湖高堿度、高礦化度的水體特點(diǎn)使得達(dá)里湖瓦氏雅羅魚群體每年4月末至5月初進(jìn)行特殊的生殖洄游，在整個(gè)洄游過程中會(huì)發(fā)生部分個(gè)體鱗片脫落的現(xiàn)象，在取樣過程中需要避免取到再生鱗。瓦氏雅羅魚鱗片在5種年齡鑒定材料中吻合率僅比耳石低，變異系數(shù)較低。鱗片的年齡讀數(shù)與耳石的年齡讀數(shù)在4齡及之前吻合率極高，而鱗片具有易獲取且對(duì)于魚的損傷小和判斷方法簡便的特點(diǎn)，故可作為鑒定低齡個(gè)體的年齡鑒定材料。

表2 同一觀察者兩次年齡讀數(shù)的吻合率和平均變異系數(shù)Tab.2 Coincidence rate and mean coefficient of variation between readers

瓦氏雅羅魚脊椎骨呈雙凹形，輪紋在內(nèi)凹面形成，不處于同一個(gè)平面，讀齡難度大，且高齡個(gè)體會(huì)出現(xiàn)重吸收的現(xiàn)象，因此，在顯微鏡下觀察容易忽略凹面深處的低齡輪紋，極易低估年齡。

耳石作為存在在魚類內(nèi)耳中的鈣鹽結(jié)晶體，營魚類聽覺和平衡的作用。與脊椎骨相比，耳石增長與外界環(huán)境相對(duì)獨(dú)立，隨著魚體生長而持續(xù)生長，不會(huì)被重吸收。只要稍加打磨至輪紋清晰即可反映魚類整個(gè)生命周期的完整生長過程，是證明瓦氏雅羅魚年齡的良好指標(biāo)之一

3.2 年齡鑒定的準(zhǔn)確性

為了提高年齡鑒定的準(zhǔn)確性，魚類工作者往往會(huì)對(duì)鈣化組織年齡鑒定進(jìn)行比較[16-17]。因?yàn)檫@是后續(xù)分析魚類種群年齡結(jié)構(gòu)、生長率、死亡率和初次性成熟年齡等參數(shù)估算準(zhǔn)確的基礎(chǔ)。本試驗(yàn)中比較3種年齡鑒定材料后可知，耳石的效果最佳，鱗片次之，脊椎骨最差，因而脊椎骨被舍棄。4齡及以下個(gè)體鱗片讀齡結(jié)果與耳石讀齡大致相符，但高齡個(gè)體的鑒定觀察結(jié)果相差較大，吻合率低，這與解玉浩等[11]使用鱗片鑒定低齡達(dá)里湖瓦氏雅羅魚，使用耳石結(jié)合鱗片鑒定高齡個(gè)體的方法相一致。從Casselman等[18]和Ma等[19]對(duì)生長緩慢的鮭魚高齡個(gè)體和異齒裂腹魚高齡個(gè)體的研究表明，耳石磨片比其他鈣化組織能更準(zhǔn)確地獲得年齡。本試驗(yàn)表明，用鱗片和脊椎骨鑒定年齡存在被低估的可能，耳石對(duì)達(dá)里湖瓦氏雅羅魚的年齡鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性優(yōu)于脊椎骨和鱗片，是瓦氏雅羅魚的最佳年齡鑒定材料。得出這一結(jié)論的原因如下：耳石位于魚類內(nèi)耳中，與外界環(huán)境相對(duì)獨(dú)立連續(xù)生長，連續(xù)生長過程中不易被重吸收；脊椎骨核心區(qū)內(nèi)凹，難以辨別首輪；鰓蓋骨、脊椎骨、匙骨邊緣角質(zhì)層較厚且渾濁，難以處理，容易缺失年輪，導(dǎo)致年齡偏差；鱗片邊緣的環(huán)形輪紋壓縮和再生鱗片的比例高，易低估達(dá)里湖瓦氏雅羅魚的年齡；達(dá)里湖為高礦化度、高堿度水體，達(dá)里湖瓦氏雅羅魚的生長受到環(huán)境的影響干擾較大，易導(dǎo)致鰓蓋骨、脊椎骨、匙骨的年輪缺失或受到干擾。

4 結(jié)論

(1)達(dá)里湖瓦氏雅羅魚耳石年齡標(biāo)志明顯，吻合率高，可判讀力高，可重復(fù)性好，是鑒定其年齡的最佳材料。

(2)鱗片易獲得，吻合率較耳石低，但也能夠準(zhǔn)確地鑒定低齡個(gè)體年齡，是鑒定瓦氏雅羅魚年齡的輔助材料。

(3)脊椎骨吻合率低，易造成年齡低估，而鰓蓋骨和匙骨邊緣角質(zhì)層較厚且渾濁，容易缺失年輪，故3種材料不宜作為年齡鑒定材料。