魏平平，李鑫，劉鷹、3，李曉豪，宋昌斌，陳濤，馬賀*，田野

(1.大連海洋大學(xué) 海洋科技與環(huán)境學(xué)院，遼寧 大連 116023；2.設(shè)施漁業(yè)教育部重點實驗室，遼寧 大連 116023；3.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室，山東 青島 266237；4.中國科學(xué)院半導(dǎo)體研究所，北京 100083；5.深圳市超頻三科技股份有限公司，廣東 深圳 518172)

紅鰭東方鲀Takifugurubripes俗稱河豚，為近海底層肉食性魚類，主要分布于北太平洋西部的日本、朝鮮半島和中國沿海，因其肉質(zhì)鮮美、價值 較高，廣受消費者的喜愛，是具有重要經(jīng)濟價值的魚種之一[1-2]。在硬骨魚類生長、發(fā)育、繁殖過程中，諸多環(huán)境因子對其內(nèi)在的生理、生化和行為產(chǎn)生影響，如溫度、食物、光周期等[3-4]。在這些環(huán)境因子中，光周期被認(rèn)為是首要的授時因子，光周期為激素的合成和釋放(即褪黑素)提供內(nèi)部同步信號，進而影響魚類的生理節(jié)律性及相關(guān)的生理功能[5]。穩(wěn)定的節(jié)律是保證海水魚類正常生長發(fā)育的必要條件。在非哺乳類脊椎動物中，光信號通過神經(jīng)通路傳遞到松果體，這些信號控制著多種激素的分泌，如生長激素、褪黑素、生殖激素等[6-7]，而激素的分泌與其相應(yīng)的基因表達密切相關(guān)，故許多研究從基因?qū)用嫣骄凯h(huán)境因子對動物的影響。

光環(huán)境因子在水生生物生長發(fā)育過程中起著重要作用，其直接或間接作用于內(nèi)分泌系統(tǒng)，從而對生長發(fā)育產(chǎn)生影響[8-11]。生長激素(Growth hormone,GH)和生長抑制激素(Somatostatin,SS)是調(diào)節(jié)生物體生長的重要內(nèi)在因子，激素的分泌又受其相應(yīng)基因表達的控制。有研究表明，紅鰭東方鲀在紅光條件下SS基因的表達水平高于綠光組，而GH基因在藍、綠、紅光下的表達水平無顯著性差異[2]，這表明光色對紅鰭東方鲀SS和GH基因的表達具有調(diào)控作用，而光周期對紅鰭東方鲀SS和GH基因的影響鮮有報道。光環(huán)境因子不僅可以影響生長相關(guān)基因的表達量，還對這些基因的晝夜表達模式產(chǎn)生影響。有研究表明，點藍子魚Siganusguttatus的GH基因表達在正常光照條件下(12L∶12D)，遵循黑暗階段表達量高、光照階段表達量低的晝夜變化模式；在全天光照組(24L∶0D)，GH基因表達的晝夜模式消失，其表達水平在全天表現(xiàn)均較穩(wěn)定；在全天黑暗組(0L∶24D)，GH基因的表達變得不規(guī)則，時高時低，未呈現(xiàn)出晝夜模式[3]。

目前，國內(nèi)外對于紅鰭東方鲀生長相關(guān)基因的表達量及晝夜表達模式研究較少，而有關(guān)光周期對這些基因的影響也未見文獻報道。因此，本研究中研究了紅鰭東方鲀幼魚時期腦組織中GH和SS基因在不同光周期下的表達水平及晝夜變化情況，旨在探究光周期對其表達量和表達模式的影響規(guī)律與機制，豐富紅鰭東方鲀的生態(tài)學(xué)理論，為其健康養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用紅鰭東方鲀幼魚(3月齡左右)購于大連天正實業(yè)有限公司，暫養(yǎng)于大連海洋大學(xué)水產(chǎn)設(shè)施養(yǎng)殖與裝備技術(shù)研究中心，待其適應(yīng)環(huán)境正常攝食后，選取健康、規(guī)格一致的幼魚(體質(zhì)量為7.89 g±0.42 g，體長為7.12 cm±0.53 cm)用于試驗。

試驗用RNA提取試劑盒RNAfast200由飛捷生物公司提供，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒TransScript?One-Step gDNA Removal and cDNA SuperMix由全式金公司提供，熒光定量PCR試劑盒FastStart Essential DNA Green Master 購于Roche公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計 試驗在兩間密閉遮光的養(yǎng)殖池內(nèi)進行，遮光材料選用深灰色遮光布，每個養(yǎng)殖池內(nèi)設(shè)置4個試驗隔間，每個試驗隔間放置3個試驗桶(直徑80 cm、深50 cm)。試驗在其中5個獨立的試驗隔間內(nèi)進行。光源采用LED新型光源(CK 54，深圳市超頻三科技股份有限公司)，光色為白色(λ400～780 nm)，選取5種光周期，分別為8L∶16D(光照時間 8：00—16：00)、12L∶12D(光照時間8：00—20：00)、16L∶8D(光照時間 8：00—24：00)、20L∶4D(光照時間 8：00—次日4：00)和24L∶0D(光照時間 8：00—次日8：00)，水面的光輻照度設(shè)定為200 mW/m2。

試驗開始時，每個光周期處理組內(nèi)設(shè)置3個平行組，共15個試驗桶，清洗消毒后的每個試驗桶內(nèi)養(yǎng)殖60尾紅鰭東方鲀幼魚。試驗期間，海水溫度控制在19～23 ℃，鹽度為31～32， pH為7.5～7.8，溶氧>6 mg/L，每天8：30投喂一次，按體質(zhì)量的2.2%進行投喂，每天換水一次，每周測定水質(zhì)參數(shù)一次，試驗周期共30 d。試驗結(jié)束后，進行24 h全天取樣，從8：00開始每隔4 h取一次樣品，從每個桶中隨機選取3尾魚取其腦組織用于測定。整個取樣過程均在碎冰上進行，腦組織取出后用液氮冷凍后于冰箱(-80 ℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 總RNA的提取和基因表達量的測定 將凍存的樣品取出后，按照總RNA提取試劑盒(RNAfast200)說明書，對腦組織樣品進行總RNA提取，利用微量分光光度計(SMA4000，merinton)所測定的RNA樣品OD260 nm/OD280 nm值確定其濃度，根據(jù) OD260 nm/OD280 nm的比值判斷總 RNA 純度，經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 質(zhì)量。

按照TransScript?One-Step gDNA Removal and cDNA SuperMix說明書步驟將RNA反轉(zhuǎn)成cDNA，以cDNA為模板使用LightCycle96 (Roche羅氏)儀器和 SG Fast qPCR Master Mix(2X) (BBI，Roche羅氏)試劑盒進行熒光定量PCR試驗。采用Primer 5軟件并根據(jù)GenBank中的cDNA全序列設(shè)計特異性引物GH、SS，引物序列見表1。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃下預(yù)變性3 min；95 ℃下變性10 s，60 ℃下退火10 s，72 ℃下延伸30 s，共進行45個循環(huán)，反應(yīng)體系為20 μL。試驗結(jié)束后對溶解曲線進行分析。所有的PCR過程中，每個RNA樣品均設(shè)3個重復(fù)。以β-actin作為內(nèi)參基因計算其2-ΔΔCt值。

表1 實時熒光定量PCR引物Tab.1 Primers for RT-qPCR

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 (mean±S.D.)表示，運用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVE)，采用LSR法進行多重比較，檢驗顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅鰭東方鲀幼魚腦組織中GH和SS基因表達量的變化

從圖1可見：GH基因的相對表達量在8L∶16D光照條件下最高且顯著高于其他光周期處理組(P<0.05)，GH基因在其他處理組的相對表達量依此為12L∶12D>16L∶8D>20L∶4D>24L∶0D；SS基因的相對表達量在8L∶16D光照條件下最高且顯著高于24L∶0D處理組(P<0.05)，其他處理組間SS基因相對表達量均無顯著性差異(P>0.05)。

2.2 GH基因的晝夜表達模式

從圖2可見：不同光周期下，GH基因的晝夜表達量表現(xiàn)出不同模式；在8L∶16D光照條件下，GH基因表達量整體呈下降趨勢，其中，高峰值出現(xiàn)在凌晨4：00，此時其相對表達量均顯著高于其他時間點的表達量(P<0.05)；在12L∶12D光照條件下，GH基因的相對表達量整體上呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，在光照階段12：00 時GH基因表達量最低，而在黑暗階段20：00 時出現(xiàn)一次高峰值；在16L∶8D和20L∶4D 光照條件下，GH基因在4：00 時相對表達量最高均顯著高于其他時間點(P<0.05)，光照階段的GH基因表達量總體低于黑暗階段的表達量，出現(xiàn)晝低夜高表達模式；在24L∶0D光照條件下，GH基因表達呈脈動式，在4：00 h和16：00 h分別出現(xiàn)一次峰值。

2.3 SS基因的晝夜表達模式

從圖3可見：不同光周期下，SS基因的晝夜表達量也表現(xiàn)出不同模式；在8L∶16D光照條件下，SS基因在8：00—16：00時表達量呈下降趨勢，在16：00 時表達量至最低且顯著低于4：00(P<0.05)，在20：00—24：00時表達量有上升的趨勢，SS基因的表達遵循晝低夜高模式；在12L∶12D光照條件下，SS基因的相對表達量在光照階段呈下降趨勢；在16L∶8D光照條件下，SS基因的表達量在黑暗和光照階段時高時低，呈無規(guī)則狀態(tài)，均在16：00 時出現(xiàn)一次峰值；在20L∶ 4D光照條件下，SS基因在16：00時出現(xiàn)一次高峰值且表達量顯著高于其他時間點(P<0.05)；在24L∶0D條件下，SS基因的相對表達量在各組間無明顯變化。

3 討論

3.1 光周期對GH和SS基因相對表達水平的影響

光周期是影響魚類生長發(fā)育、性成熟、繁殖、遷移等的重要環(huán)境因子[12-13]，其可以通過影響生長相關(guān)激素的水平調(diào)控魚類生長[14]。由脊椎動物垂體釋放的生長激素(GH)具有促進生長的作用，而GH分泌受到生長激素抑制素(SS)的控制，共同影響脊椎動物的生長發(fā)育。本試驗中，研究了5種光周期(8L∶16D、12L∶12D、16L∶8D、20L∶4D、24L∶0D)對GH和SS基因的表達情況。結(jié)果表明，隨著光照時間的延長，GH基因的表達量逐漸減少，在8L∶16D光周期處理下的GH基因表達量最高且顯著高于其他處理組。除此之外，在8L∶16D光周期處理下SS基因的相對表達量最高但僅顯著高于24L∶0D處理組。對大西洋鮭Salmonsalar幼魚的研究表明，延長光照時間可以顯著提高GH的分泌水平[15-16]。但李大鵬[17]對史氏鱘Acipenserschrenckii的研究表明，不同光周期(24L∶0D、0L∶24D、自然光)條件下GH的分泌水平無顯著性差異。目前，相關(guān)研究領(lǐng)域尚未見到光周期對生長抑制素的報道，而對其他光照因子方面的研究表明，紅鰭東方鲀幼魚的SS基因在紅光條件下的表達量顯著高于綠光組，而GH基因在藍、紅、綠光條件下無顯著性差異[2]。光信號可通過神經(jīng)通路從視網(wǎng)膜傳遞到松果體，進而控制著各種激素的分泌[3,7,18]，其中包括與生長相關(guān)的激素(GH、SS)，光周期作為光照三因子之一在激素調(diào)控方面也發(fā)揮著重要作用，由于不同魚類棲息環(huán)境有所不同，它們對外界環(huán)境變化的適應(yīng)能力也不同，因此，光周期對不同魚類激素分泌的影響具有一定的種屬特異性[19]。

3.2 光周期對GH和SS基因晝夜表達模式的影響

在許多脊椎動物中，血漿和腦組織中GH的分泌不是連續(xù)的，而是脈動的，通常遵循晝夜表達模式[3]。但也有研究表明，鮭魚Oncorhynchustshawytscha血漿中GH分泌呈現(xiàn)脈動式，而虹鱒Oncorhynchusmykiss血漿中GH分泌則是不規(guī)則的，一天中會出現(xiàn)一個或幾個峰值[20-22]。還有研究發(fā)現(xiàn)，虹鱒血漿GH水平的日變化存在晝低夜高模式[23-24]。本試驗結(jié)果顯示，在8L∶16D條件下，紅鰭東方鲀幼魚GH基因的表達總體呈現(xiàn)降低趨勢，未發(fā)現(xiàn)明顯的晝夜模式。在12L∶12D條件下，GH基因的表達遵循光照階段低、黑暗階段高的模式，這與對點藍子魚的研究結(jié)果相似[3]。在24L∶0D條件下，GH基因的表達呈脈動式，在16：00 時出現(xiàn)一次峰值，這與對點藍子魚腦組織中GH基因在長期光照中的表達模式不同[3]。有研究表明，光周期對不同魚類的影響不同，在對虹鱒的研究中發(fā)現(xiàn)，血漿中GH基因表達的峰值頻率和時間也與光周期不同步[20]。探究光周期影響GH基因表達的內(nèi)部原因試驗顯示，在12L∶12D光周期條件下點藍子魚GH基因的表達模式與褪黑素的表達模式相似，呈現(xiàn)出晝低夜高的模式[25]，根據(jù)魚類中已有研究分析表明，褪黑素通過直接作用于垂體細胞來調(diào)節(jié)GH的分泌[26]。

SS是調(diào)節(jié)脊椎動物腦組織GH合成和分泌的重要激素之一[27-28]。目前，在魚類研究中對SS基因晝夜表達模式的研究涉及的較少[29]。有報道顯示，在12L∶12D光周期條件下，紅鰭東方鲀腦組織中SS基因的表達量遵循黑暗階段高、光照階段低的模式；而在24L∶0D光照條件下，SS基因未出現(xiàn)晝低夜高表達模式[30]。本試驗中，在24L∶0D光照條件下，SS基因表達量無顯著晝夜變化，這與之前的研究結(jié)果類似；在12L∶12D光照條件下，未出現(xiàn)晝低夜高的表達模式，這可能與魚的規(guī)格有關(guān)，先前的研究采用的試驗對象規(guī)格為128.4 g[30],而本試驗采用的規(guī)格為7.89 g；在8L∶16D光照條件下，遵循晝夜模式，SS基因有光階段的表達水平低于黑暗階段。但在16L∶8D和20L∶4D光照條件下，SS基因的表達時高時低，呈現(xiàn)無規(guī)則狀態(tài)，未呈現(xiàn)出晝低夜高的表達模式。有研究表明，在光周期為24L∶0D和12L∶12D條件下，SS基因晝夜表達模式與褪黑素的晝夜分泌模式相似，均呈現(xiàn)出晝低夜高的模式[30]。分析認(rèn)為，褪黑素是由松果體分泌的一類吲哚衍生的激素，作為光周期信號調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律，其主要的分泌特征為白天分泌少夜晚分泌多[30-31]，而褪黑素的分泌會影響魚類生理活動，包括生長[32-33]。由此可以推測，紅鰭東方鲀幼魚GH和SS基因的晝夜表達模式可能與其褪黑素相關(guān)，在對莫桑比克羅非魚的研究中也發(fā)現(xiàn)，血漿褪黑素水平在夜間增加，在白天減少[34]。今后將有待進一步驗證GH和SS基因的晝夜模式與褪黑素晝夜分泌節(jié)律之間的相關(guān)性。

4 結(jié)論

本研究中通過監(jiān)測不同光周期下紅鰭東方鲀腦組織中GH和SS基因的表達量規(guī)律，探究魚類對光環(huán)境的生理反應(yīng)，得出如下結(jié)論：在8L∶16D光周期下GH基因表達量更高，且顯著高于其他處理組(P<0.05)，而8L∶16D組SS基因的相對表達量顯著高于24L∶0D組(P<0.05)，這說明SS基因與GH基因間存在相互平衡作用；GH基因在12L∶12D條件下的表達水平呈現(xiàn)晝低夜高的特點，而SS基因在8L∶16D條件下的表達水平呈現(xiàn)晝低夜高的表達特點，因此，在紅鰭東方鲀幼魚養(yǎng)殖過程中可以考慮用短時間光照(8-12h/d)。本研究結(jié)果可為紅鰭東方鲀幼魚的養(yǎng)殖提供參考依據(jù)。