馬麗 張暉 郭文治 郭航 馬亞群
1.1 實驗材料 依替福辛(美國sigma);非那司提(finasteride,F(xiàn)IN)(中國TCI);兔抗TSPO抗體(美國abcam);小鼠β-actin抗體(美國abcam);小鼠四氫孕酮 ELISA試劑盒(美國Arbor Assays);小鼠TNF-α ELISA試劑盒(美國R&D);IL-1β ELISA試劑盒(美國RD);PVDF膜、蛋白上樣緩沖液等(武漢Servicebio)。
1.2 實驗動物及POCD模型制作 C57老年小鼠(20月齡),雄性,清潔級,斯貝福生物技術(shù)有限公司提供,許可證號:SCXK(京)2015-0015。POCD模型制作過程:無菌環(huán)境中,小鼠麻醉后于腹部做中線切口,長約2 cm,結(jié)扎血管,行肝葉切除術(shù)。逐層關(guān)腹,術(shù)后保暖。
1.3 動物分組與處理 小鼠隨機分為對照組(Control組)、POCD組、POCD+EFX組、POCD+EFX+FIN組,每組24只。將所有實驗小鼠水迷宮中進行連續(xù)4 d的隱蔽平臺訓(xùn)練實驗。POCD + EFX組進行水迷宮訓(xùn)練前先進行3 d的依替福辛(50 mg/kg,溶劑為1%吐溫80+0.9%氯化鈉溶液)腹腔注射;POCD+EFX+FIN組進行水迷宮訓(xùn)練前先注射3 d的依替福辛(50 mg/kg)和非那司提(5 mg/kg,溶劑為30%羥丙基-beta-環(huán)糊精+0.9%氯化鈉溶液)。4 d的隱蔽平臺試驗訓(xùn)練完成后POCD組、EFX組、POCD+EFX+FIN組進行肝葉切除術(shù)。分別在術(shù)后第3天和第7天進行水迷宮探索實驗。
1.4 Morris水迷宮
1.4.1 Morris水迷宮是一種經(jīng)典的用于檢測實驗動物空間學(xué)習(xí)記憶能力的方法。先進行連續(xù)4 d的隱蔽平臺試驗訓(xùn)練。實驗前1 d,讓動物在不含平臺的水池中自由游泳90 s,上午、下午各1次,使其熟悉迷宮環(huán)境。實驗時平臺位置固定不變,置于東北象限中央,平臺中點離池壁22.5 cm。在平臺對側(cè)選兩個與之距離相等的點作為入水點,訓(xùn)練時將動物面朝池壁輕放入水中,記錄小鼠從入水至找到平臺的游泳路線的長度及找到平臺的時間(逃避潛伏期),然后讓小鼠在平臺上停留10 s。如果90 s內(nèi)找不到平臺,潛伏期記為90 s,并將小鼠置于平臺上休息10 s。每天在2個入水點各訓(xùn)練1次,以2次潛伏期均值作為該天的成績。
1.4.2 訓(xùn)練結(jié)束后次日進行手術(shù)。手術(shù)后在第3天、第7天進行空間探索實驗。撤除平臺,然后任選一相同入水點將小鼠放入水中,記錄小鼠在60 s內(nèi)游泳路徑,對小鼠在原平臺象限的停留時間、游泳距離百分?jǐn)?shù)及穿越平臺的次數(shù)進行統(tǒng)計分析。
1.5 標(biāo)本采集、處理 術(shù)后第3、7天,完成空間探索實驗的小鼠,每組12只,斷頭處死,迅速取出腦組織,用4℃ 0.9%氯化鈉溶液洗去血污,濾紙吸干。在冰上分離小鼠雙側(cè)海馬組織置于-80℃冰箱中貯存?zhèn)溆谩?/p>
1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用Prism統(tǒng)計軟件,對Morris水迷宮所得到的逃避潛伏期數(shù)據(jù)使用重復(fù)測量方差分析,組間比較采用正態(tài)分布和方差齊性檢驗后選擇單因素方差分析(one-way ANOVA),進一步兩兩比較采用Bonferroni-t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 Morris水迷宮結(jié)果 隱蔽平臺試驗訓(xùn)練的結(jié)果顯示在4 d的訓(xùn)練過程中,4組小鼠尋找隱蔽平臺的潛伏期、路程均呈現(xiàn)隨時間逐漸縮短趨勢,但組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。4組小鼠游泳速度各組間差異也無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。術(shù)后第3天空間探索實驗結(jié)果顯示,無論是在目標(biāo)象限時間百分?jǐn)?shù)還是在目標(biāo)象限路程百分?jǐn)?shù)組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=6.349,P=0.0012;F=6.670,P=0.0009)。Bonferroni-t檢驗進一步兩兩比較顯示:與Control組比較,POCD組小鼠在目標(biāo)象限停留時間和游泳距離明顯縮短(P<0.01);與POCD組相比,POCD+EFX組小鼠在目標(biāo)象限停留時間和游泳距離明顯延長(P<0.05);使用非那司提拮抗后,小鼠在目標(biāo)象限游泳距離再次縮短(P<0.05),但在目標(biāo)象限停留時間與POCD+EFX組雖有縮短趨勢,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。術(shù)后7 d時空間探索實驗顯示4組小鼠在目標(biāo)象限時間百分?jǐn)?shù)、目標(biāo)象限路程百分?jǐn)?shù)及穿越平臺次數(shù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。
組別目標(biāo)象限時間百分?jǐn)?shù)(%)目標(biāo)象限路程百分?jǐn)?shù)(%)平臺穿過次數(shù)(次)Control組 41.19±6.7341.89±6.482.27±1.56POCD組 28.00±8.11?29.56±9.31?1.45±1.13POCD+EFX組 38.48±9.28#39.70±8.33#2.00±1.10POCD+EFX+FIN組29.75±9.7329.61±9.38△1.33±1.10
注:與Control組比較,*P<0.01; 與POCD組比較,#P<0.05;與POCD+EFX組比較,△P<0.05
2.2 海馬TSPO的表達 術(shù)后3 d海馬TSPO蛋白水平組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=10.10,P=0.0043)。Bonferroni-t檢驗進一步兩兩比較顯示:與Control組比較,POCD組小鼠海馬水平顯著升高(P<0.05);與POCD組比較,POCD+EFX組小鼠TSPO蛋白水平與POCD組相比顯著降低(P<0.01);使用非那司提拮抗依替福辛作用后,TSPO蛋白水平雖然有所增加,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。
2.3 炎性因子的表達 術(shù)后3 d 4組小鼠海馬組織中TNF-α、IL-1β細胞因子水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=6.941,P=0.0058;F=16.00,P=0.0002)。Bonferroni-t檢驗進一步兩兩比較顯示:與Control組比較,POCD組小鼠TNF-α、IL-1β水平顯著升高(P<0.05;P<0.01);與POCD組比較,依替福辛預(yù)處理可顯著降低TNF-α、IL-1β水平(P<0.05);使用非那司提拮抗后,IL-1β水平顯著升高(P<0.05),TNF-α蛋白水平雖有所升高,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。
組別TNF-αIL-1βControl組 11.71±2.675.98±2.00POCD組 20.28±3.82?16.90±4.16#POCD+EFX組 12.17±3.00△9.14±2.30☆POCD+EFX+FIN組20.16±4.6918.79±3.31▲
注:與Control組比較,*P<0.05,#P<0.01; 與POCD組比較,△P<0.05,☆P<0.01;與POCD+EFX組比較,▲P<0.01
2.4 四氫孕酮含量 術(shù)后第3天4組小鼠海馬組織中四氫孕酮含量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=8.968,P=0.0022)。Bonferroni-t檢驗進一步兩兩比較顯示:與Control組比較,POCD組小鼠海馬內(nèi)四氫孕酮含量顯著降低(P<0.05);POCD模型小鼠接受依替福辛預(yù)處理后,海馬四氫孕酮含量顯著升高(P<0.01);而使用四氫孕酮合成抑制劑非那司提拮抗后,海馬四氫孕酮含量較POCD+EFX組又顯著降低(P<0.05)。見表3。
組別四氫孕酮含量Control組0.64±0.09POCD組0.38±0.04?POCD+EFX組0.66±0.13#POCD+EFX+FIN組0.44±0.09△F值8.968P值<0.01
注:與Control組比較,*P<0.05; 與POCD組比較,#P<0.01;與POCD+EFX組比較,△P<0.01
POCD的發(fā)生與腦內(nèi)炎癥關(guān)系密切,我們的實驗結(jié)果也提示POCD模型小鼠認(rèn)知功能較Control組顯著降低,腦內(nèi)炎性因子TNF-α、IL-1β表達顯著增加。此外,本實驗結(jié)果還顯示POCD小鼠腦內(nèi)TSPO蛋白表達也顯著增加。已知正常健康的大腦TSPO表達量較低,TSPO表達量上調(diào)目前普遍被認(rèn)為是小膠質(zhì)細胞激活的標(biāo)志。在多發(fā)性硬化患者[5]、脊髓側(cè)索硬化癥[6]、阿茲海默癥[7,8]等慢性神經(jīng)退行性疾病中,TSPO放射性配體的結(jié)合率都明顯增加,且與組織病理染色中的小膠質(zhì)細胞激活程度一致,與疾病的嚴(yán)重程度也有很強的相關(guān)性。因此雖然關(guān)于POCD模型動物腦內(nèi)TSPO如何變化,目前并未見相關(guān)報道,但可以推斷POCD腦內(nèi)炎癥的增加伴隨著小膠質(zhì)細胞的激活,同時必然存在TSPO表達水平的顯著升高。本研究結(jié)果證實了此推斷。
在我們的實驗中,依替福辛可顯著增加腦內(nèi)四氫孕酮的含量,非那司提作為四氫孕酮的合成抑制劑部分拮抗了依替福辛的作用,不僅降低了四氫孕酮的含量,還使得海馬認(rèn)知能力又有所降低,炎性因子TNF-α、IL-1β表達顯著增降低。這提示依替福辛對POCD動物模型的保護作用可能與其增加了四氫孕酮的合成有關(guān)。Daugherty等[17]在多發(fā)硬化癥模型中發(fā)現(xiàn)依替福辛的神經(jīng)保護作用可能與3α-HSD的mRNA表達增加繼而增加四氫孕酮的含量有關(guān),其中3α-HSD是四氫孕酮合成的重要反應(yīng)酶。雖然目前認(rèn)為依替福辛與TSPO蛋白結(jié)合力較低,但其在結(jié)合部位的結(jié)合實踐較長可以解釋其合成甾體類激素的的高效性[20]。既往大量實驗表明作為一種重要的甾體類激素,四氫孕酮具有顯著的神經(jīng)保護效應(yīng)[21]。其中,四氫孕酮是如今明確的唯一一種既能刺激腦神經(jīng)前體細胞增生又能緩解阿茲海默癥病理過程的化學(xué)物質(zhì),以至于目前它被認(rèn)為是治療阿茲海默癥的潛在性藥物[22]。在LPS損傷模型[23]的實驗研究中,外源性四氫孕酮的攝入也可產(chǎn)生一定的抗神經(jīng)炎癥及神經(jīng)保護作用。但目前尚未見到使用四氫孕酮進行POCD預(yù)防及治療的研究。
本研究也有一定的局限性,由于在水迷宮空間探索實驗中,4組間小鼠行為學(xué)表現(xiàn)僅在術(shù)后第3天差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),在術(shù)后第7天差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),因此我們僅進行了術(shù)后第3天的實驗室檢測。而根據(jù)文獻,炎性因子的變化可能持續(xù)至術(shù)后第7天及以后,本實驗不能明確依替福辛抗炎作用的持續(xù)時間。非那司提僅表現(xiàn)出部分拮抗作用,可能是因為樣本量不夠,或者依替福辛的神經(jīng)保護作用涉及多途徑。此外,我們雖然檢測了TSPO腦內(nèi)水平的變化,但沒有測定TSPO親和力及功能變化。
綜上所述,依替福辛作為TSPO配體在POCD動物模型中可顯著減輕炎性反應(yīng),改善認(rèn)知功能,而這種神經(jīng)保護作用可能與其增加四氫孕酮的含量有關(guān)。由于依替福辛是臨床已經(jīng)使用的藥物,加上其本身并不會對健康老年人的認(rèn)知及覺醒有任何損害[24],因此具有良好的臨床應(yīng)用前景。