陳愛國，王 巖，孟未來，李兆波，崔曉光，吳 禹

(遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新中心，遼寧 沈陽 110161)

大豆花葉病是由大豆花葉病毒(soybean mosaic virus，SMV)引起的世界性大豆病毒病害，嚴(yán)重影響大豆的產(chǎn)量和品質(zhì)，且沒有相對有效的藥劑對其進(jìn)行有效防治。因此，對大豆花葉病毒病最有效的防治措施是培育抗病品種，尋找當(dāng)?shù)亓餍胁《局晗档目乖牧?。目前，針對栽培大豆抗病材料篩選的研究較多，劉玉芝、周新安、李凱、王大剛等陸續(xù)從培育出的栽培品種中篩選出了一批抗病材料且部分已經(jīng)應(yīng)用于育種中[1～4]。然而，栽培品種遺傳背景狹窄，抗病材料的應(yīng)用有一定局限性，拓展抗性基因來源是急需解決的問題。

一年生野生大豆(Glycine soja)是栽培大豆的近緣野生種，具有豐富的遺傳多樣性，是研究大豆起源、進(jìn)化、分類的寶貴資源。其與栽培大豆間雜交結(jié)實(shí)性良好，可將野生大豆攜帶的優(yōu)異基因?qū)朐耘啻蠖怪?，因此，被認(rèn)為是改善大豆品質(zhì)、抗病性和抗逆性的重要基因來源。野生大豆未經(jīng)過人工馴化和育種篩選，因此，保留了很多抗性基因，如抗花葉病毒病、抗灰斑病、抗蚜蟲、抗包囊線蟲等基因[5]，因此，開展野生大豆抗病材料的篩選對拓寬抗病基因來源，豐富大豆品種遺傳背景具有重要意義。目前，針對野生大豆的抗病資源篩選相對較少，陳珊宇等、李開盛等、史鳳玉等分別篩選出了少數(shù)對當(dāng)?shù)夭《局晗稻哂幸欢剐缘牟牧?，本研究不僅對試驗(yàn)材料進(jìn)行了抗病鑒定，還對不同原生境來源的野生大豆資源及其重要農(nóng)藝性狀進(jìn)行了聚類分析[6～8]。

1 材料與方法

1.1 供試品種與田間播種

將2012～2015年間采集于遼寧省全省范圍內(nèi)的6 000余份野生大豆資源歸類為4種不同原生境類型：干旱地區(qū)(Ⅰ)、沿海地區(qū)(Ⅱ)、山丘地區(qū)(Ⅲ)、內(nèi)陸平原地區(qū)(Ⅳ)。分別從4個不同原生境類型中各選取品種30個，共計(jì)120個品種進(jìn)行抗病鑒定。

鑒定品種采用多年鑒定，取平均值，分別于2017年、2018年播種于遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)田內(nèi)，小區(qū)采用2 m行長，株距20 cm，每個品種種植22株，每隔20行種植1行感病品種作為接種對照。

1.2 供試病毒株系

病毒株系選用東北地區(qū)流行的SMV-1、SMV-3號株系(吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供)。每個病毒株系分別在吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院防蟲網(wǎng)室內(nèi)繁殖保存。

1.3 接種方法

采用摩擦接種法，接種前對研缽、研棒刷子等工具消毒，避免不同株系的交叉感染。取南農(nóng)1138-2上繁殖株系的癥狀典型的葉片加0.1M、pH7.3 ～7.4的磷酸緩沖液(約每1g新鮮葉片加5

ml緩沖液)和少許金剛砂(600目)在研缽中研成勻漿備用。當(dāng)供試材料第一片復(fù)葉完全展開時，用毛刷將病毒勻漿涂到展開的復(fù)葉上，30min后清水沖洗。第三片復(fù)葉展平時重復(fù)接種1次。

1.4 病情及抗性分級標(biāo)準(zhǔn)

病毒接種7d后開始抗性調(diào)查，包括癥狀類型、發(fā)病率、病級，此后持續(xù) 28d，每 7d調(diào)查1次，匯總數(shù)據(jù)并計(jì)算病情指數(shù)[9]。

單株的病情分級標(biāo)準(zhǔn)參考Zhi等的方法，分為無癥狀、花葉和壞死[10]。其中將花葉、壞死2種類型各分5級分別統(tǒng)計(jì)。若在同一植株上同時有花葉、壞死2種表現(xiàn)，則病級取5級分類中較高一方?？共⌒愿鶕?jù)各個品種的病情指數(shù)采用6級標(biāo)準(zhǔn)來確定(表1)。

表1 大豆花葉病毒抗性鑒定標(biāo)準(zhǔn)

1.5 農(nóng)藝性狀調(diào)查

對供試野生大豆品種的葉形(X1)、葉大小(X2)、花色(X3)、莢熟色(X4)、種皮色(X5)、泥膜有無(X6)、粒形(X7)、單莢粒數(shù)(X8)、百粒重(X9)、種臍色(X10)、子葉色(X11)、株高(X12)等12個關(guān)鍵農(nóng)藝性狀進(jìn)行了調(diào)查和記錄。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用浙江大學(xué)唐啟義、馮明光編寫的實(shí)用統(tǒng)計(jì)分析及其數(shù)據(jù)處理軟件DPS9.50進(jìn)行各性狀相關(guān)性分析和聚類分析[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生大豆對SMV的抗性鑒定

對不同原生境的120份野生大豆進(jìn)行田間抗SMV鑒定及其分布，結(jié)果見表2、表3。從表中可以看出，各供試野生大豆品種對2種病毒株系的病情指數(shù)變化幅度均較大，SMV-1為0%～100%，平均為48.59%，變異系數(shù)44.8%，其中表現(xiàn)為高抗的野生大豆有 1份，為 LYD140983，占比0.83%，表現(xiàn)為抗病的有7個，占供試野生大豆的5.8%，病情指數(shù)為 5.5～15.0；表現(xiàn)中抗的有 22份，病情指數(shù)為16.7～35.3，占供試野生大豆的18.3%。SMV-3病情指數(shù) 0%～

100%，平均為59.1%，變異系數(shù)44.1%，與SMV-1中表現(xiàn)不同，在SMV-3抗性鑒定中未發(fā)現(xiàn)高抗材料，表現(xiàn)為抗病的有6個，占供試野生大豆的5%，病情指數(shù)為4.1～14.5；表現(xiàn)中抗的有19份，病情指數(shù)為18.0～35.4，占供試野生大豆的15..8%。2種SMV的中感、感病、高感材料數(shù)量及病情指數(shù)差異也較大，SMV-1有70份，占供試野生大豆的58.3%，平均病情指數(shù)為57.9%；SMV-3有75份，占供試野生大豆的62.5%，平均病情指數(shù)為68.9%。

2.2 不同原生境野生大豆抗病性比較分析

由表4、表5可知，不同原生境類型的野生大豆對2中SMV的抗性表現(xiàn)有一定差異。沿海地區(qū)(Ⅱ)的材料抗性表現(xiàn)最好，平均病情指數(shù)為48.3，對SMV-1和SMV-3表現(xiàn)出中抗及以上的材料分別為13份、9份，占本類型材料的 43.3%、30%；干旱地區(qū)(Ⅰ)的材料平均病情指數(shù)為56.2，對2種SMV表現(xiàn)出中抗及以上的為6份、4份，占本類型材料的20%、13.3%；山丘地區(qū)(Ⅲ)的材料平均病情指數(shù)為56.2，對2種 SMV表現(xiàn)出中抗及以上的為7份、6份，占本類型材料的23.3%、20%；；內(nèi)陸平原(Ⅳ)的材料平均病情指數(shù)為55.3，對2種SMV表現(xiàn)出中抗及以上的為4份、6份，占本類型材料的13.3%、20%。

表2 野生大豆品種對兩種SMV的抗性反應(yīng)

表3 分別接種2種SMV后野生大豆品種的抗性分布

表4 不同原生境類型的材料對SMV-1、SMV-3株系的抗性分布

表5 不同原生境類型的材料接種2種SMV后的病情指數(shù)

2.3 野生大豆農(nóng)藝性狀及抗病性的相關(guān)性分析

由表6可知，花色與葉形、粒形與莢熟色、臍色與花色和粒形、子葉色和泥膜有無均表現(xiàn)出顯著正相關(guān)，其中臍色與花色和粒形的相關(guān)系數(shù)最高，分別為0.32和0.36。病情指數(shù)與葉大小和株高分別呈顯著負(fù)相關(guān)和顯著正相關(guān)，相關(guān)性分別為-0.17和0.14。

表6 120份野生大豆資源12個性狀及病情指數(shù)的相關(guān)系數(shù)

2.4 基于野生大豆12個農(nóng)藝性狀的聚類分析

利用DPS軟件，采用系統(tǒng)聚類，聚類距離運(yùn)用歐式距離，采用離差平方和法，對120份野生大豆種質(zhì)資源進(jìn)行聚類分析(圖1)。在9.63距離水平上，120份種質(zhì)資源聚類分為3個大組群。第Ⅰ組群僅有兩份材料，占1.7%，這兩份材料跟其他材料遺傳距離均較大，其中 LYD141046對2種SMV的抗性也較高，因此，可作為抗源材料用于抗病后代的篩選；第Ⅱ組群有 8個材料，占6.7%；大部分材料被歸為第Ⅲ組群，有110個材料，占91.6 %，在5遺傳距離水平上，第 III組群又可被劃分為若干個亞群組。從總體聚類結(jié)果看，不同原生境來源的野生大豆在不同的大群組以及亞群組中分布均衡，沒有產(chǎn)生地域性分類，因此，不同的生長環(huán)境對野生大豆農(nóng)藝性狀的多樣性沒有太大影響。

3 結(jié)論與討論

近年來，隨著抗病育種越來越受到關(guān)注，抗源材料的篩選作為抗病育種的基礎(chǔ)工作成為了眾多育種者們首要任務(wù)。以往的抗病篩選工作多以栽培大豆為材料，并且篩選到的抗病材料多為農(nóng)家品種，新培育的品種中具有較高抗性的較少[12～14]。以遺傳背景更加豐富、遺傳多樣性更高的野生大豆為材料進(jìn)行抗病資源篩選的相關(guān)報道較少。已有相關(guān)研究表明，不同的野生大豆材料間SMV抗性有顯著差異，但大部分材料屬于高感或感病，只有少數(shù)材料具有較高的抗性，并且缺少高抗或完全免疫的材料[15～16]。本研究從120份野生大豆資源中篩選出對SMV-1免疫的材料1份(LYD140983)，同時，此材料也對 SMV-3表現(xiàn)較高抗性，高抗材料的篩選比例僅為0.8%，與以往研究基本一致。

不同原生境的野生大豆對SMV的抗性表現(xiàn)略有不同，其中沿海地區(qū)的資源對 SMV-1和SMV-3均表現(xiàn)出較高的抗性，平均病情指數(shù)分別為44.8和51.7，篩選出的抗性材料所占的比例也較高，分別為43.3%、30%，其他 3個原生境類型之間則沒有明顯差異，與史鳳玉等的研究結(jié)果基本一致[17]。野生大豆作為野生資源，這可能是長期的特殊地理、氣候因素影響的自然選擇的結(jié)果。由此可見，抗病野生大豆的收集應(yīng)以沿海地區(qū)為主，對沿海地區(qū)來源的野生大豆進(jìn)行抗SMV篩選，相對更加容易得到抗病資源。

從抗病性和農(nóng)藝性狀的相關(guān)分析結(jié)果可以看出，病情指數(shù)與葉大小和株高分別呈顯著負(fù)相關(guān)和顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.17和0.14。這可能由于控制野生大豆生物產(chǎn)量的相關(guān)基因SMV抗性有一定影響，葉片較小的野生大豆材料，如披針葉、小圓葉的葉片內(nèi)部結(jié)構(gòu)特性對抵抗SMV可能有一定影響，具體原因需進(jìn)一步研究探討。對農(nóng)藝性狀的聚類分析中，未發(fā)現(xiàn)不同原生境來源的材料聚集分布，可能由于野生大豆具有較高的遺傳多樣性，在同一類型原生境中不易進(jìn)化出較為單一農(nóng)藝性狀類群。LVD140004和LYD141046與其他材料親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，其中LYD141046對2種SMV的抗性均較高，單莢粒數(shù)為4，株高為320cm，具有較高的豐產(chǎn)潛力，因此，利用 LYD141046與栽培大豆雜交，有望獲得高產(chǎn)、抗病后代。