何佳佳 韓新才 何 瑤 彭 俊 韋瑞旺 巨修煉

（武漢工程大學(xué)環(huán)境生態(tài)與生物工程學(xué)院， 武漢 430205）

辣椒是我國(guó)種植面積最多的蔬菜作物，也是經(jīng)濟(jì)價(jià)值最高的蔬菜作物，近年來(lái)種植面積在133.33萬(wàn)hm2（2 000 萬(wàn)畝）以上[1]。然而，辣椒的病害問(wèn)題依然嚴(yán)峻。

根腐病是影響田間辣椒作物產(chǎn)量的最嚴(yán)重的病害之一，由真菌引起，其中最主要的就是腐皮鐮孢菌（Fusarium solani）[2]，此類(lèi)微生物病菌在土壤里存活10 年甚至更久。部分地區(qū)由于此類(lèi)微生物病菌的危害，辣椒減產(chǎn)20%～30%，嚴(yán)重時(shí)達(dá)50%以上甚至絕產(chǎn)[3-4]。腐皮鐮孢菌引起的根腐病大大降低了田間作物辣椒的產(chǎn)量，現(xiàn)辣椒根腐病已經(jīng)成為我國(guó)辣椒生產(chǎn)和作物經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展的限制性因素之一。

苯并咪唑是制備具有殺菌活性農(nóng)藥的中間體，其衍生物低毒、抗菌、抗癌、抗寄生蟲(chóng)等，具有非常廣譜的活性，在化學(xué)、醫(yī)學(xué)以及農(nóng)業(yè)領(lǐng)域都得到了廣泛關(guān)注[5-6]。20 世紀(jì)80 年代以來(lái)，苯并咪唑類(lèi)殺菌劑得到廣泛的使用，在農(nóng)業(yè)上可防治多種真菌病害，如大多數(shù)子囊菌、半知菌和擔(dān)子菌等引起的病害，效果非常顯著[7]。

隨著原有的苯并咪唑類(lèi)殺菌劑使用時(shí)間的延長(zhǎng),土壤殘留危害越來(lái)越嚴(yán)重，病害菌的抗性變得越來(lái)越強(qiáng),導(dǎo)致殺菌劑的活性持續(xù)降低, 甚至在一些地區(qū)喪失了殺菌能力[8-9]。因此，有必要研發(fā)出具有發(fā)展?jié)摿Φ男滦娃r(nóng)藥來(lái)解決當(dāng)下問(wèn)題。

本研究通過(guò)測(cè)定12 種新型苯并咪唑類(lèi)化合物對(duì)辣椒根腐病菌—腐皮鐮孢菌（Fusarium solani）的抑菌活力和毒力，探究其是否對(duì)腐皮鐮孢菌具有殺菌潛力，為辣椒根腐病新型殺菌劑的研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試藥劑

12 種新型苯并咪唑類(lèi)化合物[10]，分析純，名稱(chēng)及結(jié)構(gòu)見(jiàn)表1，由武漢工程大學(xué)巨修煉教授團(tuán)隊(duì)化合物合成。

丙酮、分析純、助溶劑，用于溶解新型苯并咪唑類(lèi)化合物。

1.2 供試菌株

辣椒根腐病菌—腐皮鐮孢菌（Fusarium solani），由武漢農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜所提供。

1.3 培養(yǎng)基

PSA 培養(yǎng)基，配方：土豆200 g、蔗糖20 g、瓊脂粉18 g、水1 000 mL。

1.4 含藥培養(yǎng)基制備的方法

稱(chēng)取0.02 g 化合物于燒杯中，無(wú)菌條件下取5 mL 丙酮至燒杯中溶解，加5 mL 無(wú)菌水，從而獲得2 000 μg/mL 的母液；迅速移至微小管，標(biāo)記。取1 mL 母液至培養(yǎng)皿中，加入9 mL 配制好的PAS 培養(yǎng)液，冷卻凝固待用。

1.5 抑菌率的測(cè)定

在含200 μg/mL 新型苯并咪唑類(lèi)化合物的PSA 培養(yǎng)基上，接種同一菌齡且直徑為5 mm 的辣椒根腐病菌菌餅，重復(fù)3 次，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d 左右，當(dāng)對(duì)照菌落快長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)皿時(shí)，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，取平均值，分別計(jì)算12 種新型苯并咪唑類(lèi)化合物的菌絲抑菌率。

表1 新型苯并咪唑類(lèi)化合物名稱(chēng)結(jié)構(gòu)

1.5 EC50 值的測(cè)定

初篩后，對(duì)抑菌率最大的3 種新型苯并咪唑類(lèi)化合物進(jìn)行毒力回歸分析。用丙酮溶解一定量待測(cè)化合物，加等量水獲得一定濃度母液，再稀釋成5個(gè)不同濃度，獲得試驗(yàn)所需濃度梯度，分別測(cè)定其抑菌率。以待測(cè)化合物濃度數(shù)值為自變量X，以菌絲抑菌率機(jī)率值為因變量Y，利用SPSS 軟件計(jì)算出毒力回歸方程和相關(guān)系數(shù)R，根據(jù)回歸方程求出EC50值。以EC50值的大小評(píng)定新化合物的生物活性與毒力大小，確定殺菌效果最好的化合物。

2 結(jié)果與分析

2.1 新型苯并咪唑類(lèi)化合物對(duì)辣椒根腐病菌的抑菌效果

12 種新型苯并咪唑類(lèi)化合物濃度都為200 μg/mL 時(shí)，測(cè)定其對(duì)辣椒根腐病菌抑菌率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 結(jié)果表明，12 種新型苯并咪唑類(lèi)化合物對(duì)辣椒根腐病菌均有一定的抑菌活性，抑菌率為46.56% ～83.96%，編號(hào)對(duì)應(yīng)化合物抑菌率分別為：D7e 83.96%、D7k 79.62%、D7i 77.25%、D7g 75.83%、D7f 75.47%、D7h 75.12%、D7b 74.21%、D7j 72.60%、D7a 72.15%、D7c 61.64%、D7d 54.48%、D7l 46.60%。抑菌率大小順序：D7e ＞D7k ＞D7i ＞D7g ＞D7f ＞D7h ＞D7b ＞D7j ＞D7a ＞D7c ＞D7d ＞ D7l。其中，抑菌率最高的3 個(gè)化合物為N-(3- 氯芐基 )-1H- 苯并咪唑（編號(hào)D7e）、N-(3,5- 二氯芐基 )-1H- 苯并咪唑（編號(hào)D7k）和N-(3,4- 二氯芐基 )-1H- 苯并咪唑（編號(hào)D7i），其抑菌率分別為83.96%、79.62%和77.25%；抑菌率最低的化合物是N-(2,4-二羥基芐基)-1H-苯并咪唑（編號(hào)D7l）,其抑菌率僅為46.60%。

表2 12 種新型苯并咪唑類(lèi)化合物對(duì)辣椒根腐病菌的抑菌效果

從結(jié)構(gòu)上看，苯并咪唑類(lèi)化合物中取代基不同，其抑菌效果具有明顯差異。

（1）苯并咪唑類(lèi)化合物中，含鹵族取代基的化合物抑菌效果最好。其中，3-氯取代物抑菌率最高，如N-(3- 氯芐基 )-1H- 苯并咪唑的抑菌率達(dá)83.96%；3-溴取代物次之，如N-(3-溴芐基)-1H-苯并咪唑的抑菌率為75.83%；4-氟取代物最差，如N-(4-氟芐基)-1H-苯并咪唑的抑菌率為54.48%。

（2）苯并咪唑類(lèi)化合物中，含甲基取代基的化合物抑菌效果一般，如N-(3-甲基芐基)- 1H-苯并咪唑和N-(4-甲基芐基)-1H-苯并咪唑，其抑菌率分別為72.15%和74.21%。

（3）苯并咪唑類(lèi)化合物中，2,4 二羥基取代化合物抑菌活性最低，如N-(2,4-二羥基芐基)-1H-苯并咪唑,其抑菌率僅為46.60%。

2.2 目標(biāo)化合物對(duì)辣椒根腐病菌的毒力回歸分析

N-(3- 氯芐基 )-1H- 苯并咪唑（編號(hào)D7e）、N-(3,5- 二氯芐基 )-1H- 苯并咪唑（編號(hào)D7k）和N-(3,4- 二氯芐基 )-1H- 苯并咪唑（編號(hào)D7i）3 種化合物對(duì)辣椒根腐病菌的毒力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3～6。從表3 ～6 可以看出，其3 種化合物對(duì)辣椒根腐病菌的毒力回歸方程分別為y=2.7044 +1.4616x、y=3.9468 +0.8658x、y=2.8484 +1.1963x；建立該回歸方程的相關(guān)系數(shù)（R）分別為0.9902、0.9940、0.9981，相關(guān)性較好；抑菌中質(zhì)量濃度EC50分別為36.92 μg/mL、16.19 μg/mL、62.88 μg/mL。

表3 D7e 濃度梯度抑菌率

表4 D7k 濃度梯度抑菌率

表5 D7i 濃度梯度抑菌率

表6 三種新化合物對(duì)棉花枯萎病菌抑菌的毒力回歸分析

根據(jù)EC50的大小，EC50值越小，表明毒力越大，3 種目標(biāo)化合物對(duì)辣椒根腐病菌的毒力大小為：D7k ＞ D7e ＞ D7i。因此，N-(3,5- 二氯芐基 )-1H- 苯并咪唑（編號(hào)D7k）是12 種新型苯并咪唑類(lèi)化合物中對(duì)辣椒根腐病菌毒力最大的化合物，最具有開(kāi)發(fā)成為新型殺菌劑的潛力。

3 討論

現(xiàn)在市場(chǎng)上廣泛應(yīng)用的苯并咪唑類(lèi)殺菌劑，如多菌靈、苯菌靈、噻菌靈等，出現(xiàn)了較強(qiáng)的抗藥 性[11]，對(duì)作物病害的殺菌防病效果大幅度下降，使用情況并不理想，而且有害物質(zhì)殘留也很?chē)?yán)重，破壞生態(tài)系統(tǒng)，引發(fā)一系列環(huán)境污染問(wèn)題[12]，開(kāi)發(fā)應(yīng)用新型苯并咪唑類(lèi)殺菌劑迫在眉睫。

本研究測(cè)定出了這12 種新型苯并咪唑類(lèi)化合物對(duì)辣椒根腐病菌的抑菌率和毒力，并篩選出最具有研發(fā)前景的3 種化合物，分別是N-(3,5- 二氯芐基 )-1H- 苯并咪唑、N-(3- 氯芐基 )-1H- 苯并咪唑和N-(3,4- 二氯芐基 )-1H- 苯并咪唑，為新的殺菌劑的研發(fā)提供了一定的科學(xué)依據(jù),其安全性以及是否有殘留還有待進(jìn)一步研究。