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        辛伐他汀對(duì)SCID鼠增生性瘢痕模型的抑制作用研究

        2020-03-17 09:30:18陳俊偉李帆楊艷清
        中國(guó)美容醫(yī)學(xué) 2020年1期
        關(guān)鍵詞:辛伐他汀

        陳俊偉 李帆 楊艷清

        [摘要]目的:建立重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠增生性瘢痕模型,并觀察辛伐他汀乳膏外用對(duì)瘢痕的抑制作用。方法:取4周齡SCID小鼠12只,將手術(shù)切除的人類(lèi)瘢痕組織皮片移植到其背部,1周后將小鼠隨機(jī)分為3組,分別為模型組、乳膏基質(zhì)組和1%辛伐他汀乳膏組,連續(xù)外用藥物2周后,取各組移植瘢痕組織行HE染色、Masson染色;堿水解-分光光度法檢測(cè)瘢痕組織中羥脯氨酸(HPr)含量。結(jié)果:植皮后1周,鼠背可觀察到黃褐色、隆起于皮面、質(zhì)地柔韌的類(lèi)瘢痕組織,組織病理學(xué)可見(jiàn)排列紊亂的粗大膠原束,呈結(jié)節(jié)狀或漩渦狀排列,符合增生性瘢痕的特點(diǎn)。外用1%辛伐他汀乳膏2周后,真皮纖維化程度較模型組有所緩解,膠原含量減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論:SCID鼠增生性瘢痕模型類(lèi)似于人類(lèi)增生性瘢痕,1%辛伐他汀乳膏可抑制該動(dòng)物模型瘢痕組織增生。

        [關(guān)鍵詞]辛伐他汀;SCID小鼠;增生性瘢痕;纖維化

        [中圖分類(lèi)號(hào)]R619+.6 ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A ? ?[文章編號(hào)]1008-6455(2020)01-0055-03

        Inhibitory Effect of Simvastatin on Hypertrophic Scar Model of SCID Mice

        CHEN Jun-wei,LI Fan,YANG Yan-qing

        (Department of Plastic Surgery,the Third Hospital of Wuhan,Tongren Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,Hubei,China)

        Abstract: Objective ?To investigate the inhibitory effect of simvastatin cream on established hypertrophic scar model of severe combined immunodeficiency (SCID) mice. Methods ?Human split-thickness skin grafts of hypertrophic scar were transplanted onto the dorsum of 12 four weeks old SCID mice. After one week, the mice were randomly divided into 3 groups: model control group, vehicle only group and 1% simvastatin cream group. After two consecutive weeks of treatment, the hypertrophic scar xenografts were harvested and given biopsy for histology by HE and Masson staining. Besides, alkaline hydrolysis-spectrophotometry was used to determine the level of hydroxyproline in hypertrophic scar xenografts. Results ?After one week of transplantation, the xenografts showed characteristic human hypertrophic scar including a yellowish brown, firm and elevated appearance. Histopathology showed disordered thick collagen fibrils arranged in nodular or whirlpool shape. After two weeks treatment of 1% simvastatin cream, the dermal fibrosis was alleviated and collagen content was decreased compared with model control group, the difference was statistically significant(P<0.01). Conclusion ?The hypertrophic scar model of SCID mice is similar to that of human hypertrophic scar and 1% simvastatin cream could inhibit the scar development in this animal model.

        Key words: simvastatin; SCID mice; hypertrophic scar; fibrosis

        人體皮膚組織損傷后過(guò)度修復(fù)可發(fā)生增生性瘢痕(Hypertrophic scar,HS),由于其具體的分子生物學(xué)機(jī)制尚不清楚,目前臨床中并無(wú)特異性根治方法。近些年來(lái)常用的方法有手術(shù)、激光、藥物局部注射和放射治療等,但是存在治療周期長(zhǎng)、復(fù)發(fā)率高和個(gè)體差異大等問(wèn)題,且選擇單一的治療方法通常無(wú)法達(dá)到滿(mǎn)意的效果[1]。因此,迫切需要開(kāi)發(fā)一種新型的治療藥物,單獨(dú)使用或與當(dāng)前的治療手段相結(jié)合,從而在對(duì)患者損傷最小的前提下,達(dá)到最佳的治療效果。

        辛伐他?。⊿imvastatin)是一種羥甲基戊二?;o酶A(HMG-ConA)還原酶抑制劑,用于治療高膽固醇血癥,近來(lái)有報(bào)道辛伐他汀可減少兔耳增生性瘢痕的形成[2]。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)辛伐他汀可抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡[3]。重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠(Severe combined immunodeficiency mouse, SCID小鼠)是一種純合子基因突變鼠,其細(xì)胞免疫和體液免疫功能均有缺陷,可作為人類(lèi)皮膚移植的理想受體[4]。本次通過(guò)構(gòu)建SCID小鼠增生性瘢痕模型,驗(yàn)證該模型的可行性,并進(jìn)一步探討辛伐他汀治療的可能性與分子機(jī)制。

        1 ?材料和方法

        1.1 主要試劑:辛伐他汀原藥粉購(gòu)于美國(guó)Calbiochem公司(CAS號(hào):79902-63-9),1%辛伐他汀乳膏和乳膏基質(zhì)由武漢大學(xué)同仁醫(yī)院藥劑科自制,Masson染色試劑盒購(gòu)于福州邁新公司,羥脯氨酸試劑盒購(gòu)買(mǎi)于南京建成生物工程研究所。4周齡雌性SCID Beige小鼠(質(zhì)量合格證編號(hào):11400700230963)購(gòu)買(mǎi)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,飼養(yǎng)于武漢大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室。

        1.2 模型制備、動(dòng)物分組和藥物處理:參照文獻(xiàn)[5-7]報(bào)告的方法構(gòu)建動(dòng)物模型。移植人類(lèi)瘢痕組織來(lái)源于武漢大學(xué)同仁醫(yī)院整形科瘢痕畸形整復(fù)術(shù)中切除的皮膚組織。術(shù)中征得患者知情同意,本研究通過(guò)武漢大學(xué)同仁醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。將切取的瘢痕組織盡量去除皮下脂肪,修剪為1cm×1.5cm的長(zhǎng)方形皮片,生理鹽水紗布包裹,快速低溫送至動(dòng)物房備用移植。SCID小鼠隨機(jī)分為3組,模型組(皮片移植)、乳膏基質(zhì)組(皮片移植+外擦乳膏基質(zhì))、1%辛伐他汀組(皮片移植+外擦辛伐他汀乳膏),每組4只。給予SCID小鼠七氟醚吸入麻醉,對(duì)其背部進(jìn)行脫毛,消毒后剪開(kāi)至筋膜層,使用可吸收縫線將備用皮片縫合,邊緣仔細(xì)對(duì)合,術(shù)后將小鼠分籠飼養(yǎng)。造模1周后,乳膏基質(zhì)組與辛伐他汀組分別外用乳膏基質(zhì)與1%辛伐他汀乳膏,每日2次,連用2周。

        1.3 組織學(xué)病理檢查:外用藥物2周后處死小鼠,將背部移植瘢痕組織連帶周?chē)糠终J笃ひ煌∠?。?jīng)過(guò)4%多聚甲醛固定后24h,石蠟包埋并制備5μm厚的切片,之后分別進(jìn)行HE染色及Masson染色。正置顯微鏡下觀察并攝取圖片。主要觀察以下指標(biāo):①瘢痕組織形態(tài);②膠原形態(tài)及排列。每張切片隨機(jī)選取3個(gè)200倍放大的視野,使用Olympus機(jī)載顯微圖像數(shù)字化分析軟件測(cè)量各個(gè)組的真皮厚度。

        1.4 瘢痕組織羥脯氨酸(HPr)含量測(cè)定:動(dòng)物組織中HPr的測(cè)定可用來(lái)反映皮膚總膠原的含量。參照試劑盒的說(shuō)明書(shū),使用NaOH將組織中HPr多肽水解為游離的HPr,經(jīng)過(guò)氧化反應(yīng)可生成紅色的吡咯化合物。約50g瘢痕組織經(jīng)過(guò)勻漿、消化和水解等步驟,取上清后于分光光度計(jì)550nm處測(cè)量各管的吸光度值。皮膚總膠原含量(mg/g)=HPr(mg/g)/12.5%。

        1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,所有計(jì)量資料使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x?±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,處理組與模型組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 ?結(jié)果

        2.1 增生性瘢痕模型觀察:植皮后1周,移植瘢痕皮片組織與小鼠周?chē)Fつw基本對(duì)接,顏色為蠟黃色,質(zhì)地柔軟,周?chē)梢?jiàn)灰褐色邊界(見(jiàn)圖1)。

        2.2 HE染色結(jié)果:模型建造成功后開(kāi)始用藥,2周后取組織行HE染色。從HE染色結(jié)果中可見(jiàn),瘢痕組織與周?chē)笃缀跬耆B接。因小鼠表皮與真皮較薄,真皮下可見(jiàn)脂肪組織,有明顯毛囊結(jié)構(gòu),組織學(xué)結(jié)果中可清晰分界小鼠皮膚與人類(lèi)瘢痕組織。模型組瘢痕組織真皮內(nèi)可見(jiàn)大量膠原纖維束,排列致密、紊亂、紅染,呈漩渦狀或結(jié)節(jié)狀,符合增生性瘢痕的組織病理學(xué)表現(xiàn)。乳膏基質(zhì)組較模型組無(wú)明顯差異。1%辛伐他汀組與模型組相比膠原纖維有所減少,染色強(qiáng)度減弱(見(jiàn)圖2)。

        2.3 Masson染色結(jié)果:Masson染色可更加清晰顯示真皮層纖維化程度。模型組與乳膏基質(zhì)組染色結(jié)果顯示,真皮層可見(jiàn)大量致密深染的粗大膠原纖維,1%辛伐他汀組著色程度有所下降,纖維化程度降低,膠原纖維含量有所減少,染色強(qiáng)度減弱(見(jiàn)圖3)。

        2.4 真皮厚度及皮膚總膠原含量測(cè)定:通過(guò)測(cè)定羥脯氨酸的含量可反映皮膚總膠原的含量。治療2周后,乳膏基質(zhì)組與模型組相比,總膠原含量及真皮厚度無(wú)明顯改變(P>0.05)。1%辛伐他汀組與模型組相比,總膠原含量明顯減少(P<0.01),但兩組間真皮厚度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

        3 ?討論

        皮膚作為人體最大的器官構(gòu)成防御外界刺激的第一道屏障,當(dāng)皮膚受到深達(dá)真皮層的創(chuàng)傷后,成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖并產(chǎn)生大量細(xì)胞外基質(zhì)可形成增生性瘢痕,由于其發(fā)生的具體分子機(jī)制尚無(wú)定論,目前暫無(wú)令人滿(mǎn)意的預(yù)防或治療策略。合適的動(dòng)物模型對(duì)于疾病的科學(xué)研究至關(guān)重要,不僅為探索其病理發(fā)展過(guò)程提供基礎(chǔ),更可在一定程度上縮短新藥的研發(fā)進(jìn)程。由于不同種系的特異性,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的普通創(chuàng)面愈合過(guò)程通常較快且無(wú)明顯瘢痕形成。中國(guó)學(xué)者李薈元等于1998年首先建立了兔耳增生性瘢痕模型,并觀察了不同形狀和深度的創(chuàng)面對(duì)此模型中瘢痕組織膠原含量、組織病理及蛋白表達(dá)等指標(biāo)的影響,對(duì)后期國(guó)內(nèi)學(xué)者研究增生性瘢痕模型具有開(kāi)創(chuàng)性的意義[8-9]。該兔耳模型組織病理主要為成纖維細(xì)胞增殖及膠原沉積,類(lèi)似人體增生性瘢痕。由于兔耳與人體皮膚組織結(jié)構(gòu)存在差異,有學(xué)者觀察到兔耳軟骨組織受創(chuàng)與該模型有一定關(guān)聯(lián),這種改變與人體增生性瘢痕的形成存在差別[10-12]。在本實(shí)驗(yàn)嘗試將人類(lèi)瘢痕組織皮片移植至SCID小鼠背部,并驗(yàn)證該增生性瘢痕動(dòng)物模型的可行性。SCID小鼠由于細(xì)胞免疫和體液免疫均存在缺陷,對(duì)異物的排斥反應(yīng)明顯降低,可作為人體組織移植的理想受體[4]。研究表明,SCID小鼠與目前國(guó)內(nèi)應(yīng)用較多的裸鼠相比,前者更適宜建立腫瘤移植動(dòng)物模型,移植成功率高于后者[13-14]。本次觀察了人類(lèi)皮膚增生性瘢痕組織移植到SCID小鼠背部后,瘢痕組織的存活情況并行組織學(xué)活檢,結(jié)果表明,術(shù)后1周,移植皮膚瘢痕組織質(zhì)地柔軟,顏色有所加深,邊緣呈灰褐色且輕度高出皮面。術(shù)后3周取皮損行組織病理學(xué)觀察,可見(jiàn)人體皮膚組織與周?chē)笃ぞo密連接,且符合增生性瘢痕的膠原分布特點(diǎn),進(jìn)一步證實(shí)了該小鼠瘢痕模型的可行性。然而,本實(shí)驗(yàn)中觀察到,SCID小鼠背部移植的瘢痕組織在3周后開(kāi)始萎縮消退,周?chē)J笃ぶ饾u向移植區(qū)擴(kuò)大并最終將其完全替代,這與增生性瘢痕組織在人類(lèi)皮膚上長(zhǎng)期存在且數(shù)年無(wú)消退不相符,考慮與瘢痕組織所處的微環(huán)境發(fā)生改變有關(guān),且SCID小鼠免疫系統(tǒng)缺陷影響了瘢痕組織的發(fā)展演變過(guò)程,后期擬通過(guò)將瘢痕組織皮下埋植或皮膚牽張器干預(yù)等方法改善此動(dòng)物模型,以期延長(zhǎng)移植瘢痕組織的存活時(shí)間。

        在創(chuàng)傷愈合過(guò)程中,促進(jìn)或抑制纖維化的細(xì)胞因子相應(yīng)地表達(dá)增高或者減低,正常的膠原合成與降解穩(wěn)態(tài)被破壞,大量膠原合成并堆積于真皮層,形成了增生性瘢痕的基本病理改變[15]。其中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)是瘢痕形成中的關(guān)鍵效應(yīng)因子,在瘢痕的增殖期其受體表達(dá)明顯增強(qiáng),信號(hào)通路被激活引起細(xì)胞外基質(zhì)大量分泌[16]。目前臨床上已證實(shí)有效的藥物有激素類(lèi)、鈣離子拮抗劑、抗腫瘤藥物等[17]。此外,有研究表明,辛伐他汀可阻斷TGF-β1/Smad2,3信號(hào)通路,抑制成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原的產(chǎn)生[18]。低氧條件下,辛伐他汀還可抑制瘢痕組織成纖維細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡[19]。此外,有學(xué)者通過(guò)機(jī)械損傷在兔耳廓部構(gòu)建增生性瘢痕,觀察到局部瘢痕內(nèi)注射他汀類(lèi)藥物可抑制兔耳瘢痕組織發(fā)展[20]。本次將人類(lèi)瘢痕組織植入SCID小鼠背部建立增生性瘢痕模型,觀察外用辛伐他汀對(duì)該模型的影響。Masson染色結(jié)果表明,經(jīng)1%辛伐他汀乳膏局部治療2周后,瘢痕組織的纖維化程度和范圍與模型組相比明顯減小。此外,真皮厚度也有所變薄。羥脯氨酸作為膠原合成的特有原料,含量恒定,其數(shù)值可反應(yīng)皮膚的總膠原含量。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)辛伐他汀外用2周后,皮膚總膠原含量顯著低于模型組,表明辛伐他汀通過(guò)抑制膠原沉積可起到治療瘢痕的作用。

        綜上所述,將瘢痕組織移植到SCID小鼠背部可模擬人類(lèi)增生性瘢痕,為研究增生性瘢痕的發(fā)展演變過(guò)程及篩選治療手段提供科研基礎(chǔ)。辛伐他汀通過(guò)調(diào)節(jié)真皮纖維化、影響真皮層厚度及抑制膠原合成發(fā)揮治療瘢痕的作用。然而,本研究中建立的動(dòng)物模型瘢痕組織存活時(shí)期較短,仍需進(jìn)一步改善。目前,辛伐他汀對(duì)瘢痕的體內(nèi)治療作用均局限于動(dòng)物模型,仍需嚴(yán)格的藥物臨床試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證其有效性和安全性。

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        [收稿日期]2019-07-22

        本文引用格式:陳俊偉,李帆,楊艷清.辛伐他汀對(duì)SCID鼠增生性瘢痕模型的抑制作用研究[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué),2020,29(1):55-58.

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