黃金智，謝賢聰，張玲莉，譚曉瑜，張 穎* （.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東湛江5400；.廣東醫(yī)科大學(xué)，廣東湛江 5403）

目前腹腔鏡技術(shù)在外科手術(shù)中運(yùn)用越來越廣泛。因腹腔鏡術(shù)常需建立CO2氣腹通道，而氣腹可能造成腹部膨脹，導(dǎo)致腹壓上升，某些惡性腫瘤經(jīng)腹腔鏡術(shù)后，由于高壓力的CO2氣腹有可能引發(fā)惡性腫瘤的種植轉(zhuǎn)移[1-2]。為研究Beclin1表達(dá)增高在CO2氣腹中是否能夠促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞株SKOV3的增殖、遷移，分析其是否存在伴隨CO2氣腹時(shí)間延長而提升腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，本課題以卵巢癌細(xì)胞株SKOV3為研究對象，模擬CO2氣腹環(huán)境，探索促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增值轉(zhuǎn)移能力的分子機(jī)制，為腹腔鏡臨床應(yīng)用安全性的評估提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 模塊化培養(yǎng)室和流量計(jì)購自比盧普斯羅森堡公司；CO2氣罐和減壓閥購自湛江氧氣廠。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3購自上海典藏細(xì)胞庫；過表達(dá)質(zhì)粒、空質(zhì)粒、干擾表達(dá)質(zhì)粒及陰性對照質(zhì)粒購于上海吉瑪公司； Beclin1和GAPDH引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成；兔抗人Beclin1多克隆抗體、抗兔單克隆抗體、兔抗人GAPDH單克隆抗體購自美國Abcam公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司；Transwell小室購自康寧公司； WST-1試劑盒購自碧云天公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購自天根公司。

1.2 方法

1.2.1 人工模擬CO2氣腹的建立 采用模塊化孵育箱及其CO2氣罐模擬CO2氣腹環(huán)境，進(jìn)氣壓力恒定，對SKOV3細(xì)胞株作用3 h。CO2作用期間將模塊化孵育箱置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，盡量與臨床腹腔鏡環(huán)境接近，建立人卵巢癌SKOV3細(xì)胞株CO2氣腹模型。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法，分為Beclin1過表達(dá)組、對應(yīng)的GV362空質(zhì)粒組、Beclin1干擾表達(dá)組、對應(yīng)的pGPH1空質(zhì)粒組、單純脂質(zhì)體組(空白對照組)，處理時(shí)CO2壓力相同，作用時(shí)間相同。

1.2.3 qRT-PCR實(shí)驗(yàn) 5組細(xì)胞分別提取細(xì)胞總RNA，測定RNA濃度和純度，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量。

1.2.4 Western blot實(shí)驗(yàn) 5組細(xì)胞分別提取總蛋白，BCA(Bicinchoninic acid)法測定蛋白濃度，制備上樣蛋白，免疫印跡以觀察各組蛋白的表達(dá)情況。

1.2.5 超氧化物歧化酶法(WST-1)檢測細(xì)胞增殖 細(xì)胞鋪板，建立模擬氣腹環(huán)境，按照試劑盒說明書配置 WST-1 溶液。除上述 5組，另設(shè)立空白孔(即無細(xì)胞孔，孔內(nèi)加入同量的培養(yǎng)基)，將各處理組置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，經(jīng)CO2氣腹模型處理3 h，繼續(xù)于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24 h，然后每孔加入10 μL WST-1溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀檢測492 nm 處的吸光度，分析細(xì)胞增殖情況。

1.2.6 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞鋪板，建立模擬氣腹環(huán)境，5組細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，步驟同上。造模后，消化細(xì)胞，在Transwell小室的上室接種1×105個(gè)細(xì)胞，下室內(nèi)加入500 μL含有2%胎牛血清的 RPMI1640 培養(yǎng)液，培養(yǎng)2 h，建立CO2氣腹，然后進(jìn)行固定、染色，顯微鏡高倍鏡下觀察細(xì)胞遷移情況并計(jì)數(shù)，對比各組遷移細(xì)胞數(shù)的差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 5進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用±s表示，多個(gè)樣本之間的比較，滿足方差齊性的條件下采用單因素方差分析及LSD檢驗(yàn)，不滿足方差齊性的條件下采用單因素方差分析及Dunnett T 3檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染效果

轉(zhuǎn)染24 h后觀察熒光表達(dá)，隨機(jī)5個(gè)高倍鏡熒光表達(dá)如圖1，轉(zhuǎn)染效率為40%～50%，轉(zhuǎn)染成功。

圖1 轉(zhuǎn)染24 h后熒光表達(dá) (×400)

2.2 Beclin1的mRNA表達(dá)情況

RT-PCR檢測Beclin1的mRNA表達(dá)情況，由圖2可知：與脂質(zhì)體空白對照組和空質(zhì)粒(轉(zhuǎn)染各自的空載體質(zhì)粒GV362和pGPH1)組相比，轉(zhuǎn)染Beclin1過表達(dá)質(zhì)粒組的Beclin1 mRNA表達(dá)明顯增高，而轉(zhuǎn)染Beclin1干擾表達(dá)質(zhì)粒組的Beclin1 mRNA表達(dá)則明顯受到抑制，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)?？瞻讓φ战M與空質(zhì)粒組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 Beclin1蛋白表達(dá)情況

Western blot檢測Beclin1的表達(dá)情況，由圖3、4可知，Beclin1過表達(dá)組與脂質(zhì)體空白對照組和GV362空質(zhì)粒組比較，Beclin1蛋白表達(dá)明顯增高；Beclin1干擾表達(dá)組與脂質(zhì)體空白對照組和pGPH1空質(zhì)粒組比較，Beclin1蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)?？瞻讓φ战M與空質(zhì)粒組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 WST-1細(xì)胞增殖結(jié)果

WST-1細(xì)胞增殖結(jié)果如圖5所示，Beclin1過表達(dá)組與脂質(zhì)體空白對照組和GV362空質(zhì)粒組比較，細(xì)胞增值率明顯增高；Beclin1干擾表達(dá)組與脂質(zhì)體空白對照組和pGPH1空質(zhì)粒組比較，細(xì)胞增殖率則明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。空白對照組與空質(zhì)粒組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖3 Beclin1的蛋白表達(dá)情況

2.5 Tanswell細(xì)胞遷移

Tanswell小室遷移結(jié)果如圖6、7所示，Beclin1過表達(dá)組與脂質(zhì)體空白對照組和GV362空質(zhì)粒組比較，遷移入下室的細(xì)胞明顯增多；Beclin1干擾表達(dá)組與脂質(zhì)體空白對照組和pGPH1空質(zhì)粒組比較，遷移入下室的細(xì)胞明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)?？瞻讓φ战M與空質(zhì)粒組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖4 各組Beclin1蛋白相對表達(dá)量的比較

圖5 各組細(xì)胞增殖率的比較

圖6 各組細(xì)胞結(jié)晶紫染色在高倍顯微鏡下的結(jié)果(×200)

圖7 各組細(xì)胞遷移數(shù)的比較

3 討論

目前腹腔鏡技術(shù)已運(yùn)用于多種普通腹部外科疾病的診治。但近年來研究發(fā)現(xiàn)某些惡性腫瘤經(jīng)腹腔鏡術(shù)后，容易出現(xiàn)穿刺孔或腹腔內(nèi)轉(zhuǎn)移[1-2]，其在治療惡性腫瘤中的應(yīng)用，醫(yī)學(xué)界出現(xiàn)一些異議。因?yàn)楦骨荤R術(shù)中通常需建立CO2氣腹通道，而氣腹可能造成腹部膨脹，導(dǎo)致腹壓上升。相關(guān)研究表明高壓力CO2氣腹產(chǎn)生的機(jī)械性壓迫和CO2吸收所致的不利影響表現(xiàn)在呼吸、循環(huán)、消化、神經(jīng)內(nèi)分泌和炎性應(yīng)激等多個(gè)方面[3-6]。其中最令人關(guān)注的是高壓力的CO2氣腹有可能引發(fā)惡性腫瘤的種植轉(zhuǎn)移。CO2氣腹促進(jìn)腫瘤生長和擴(kuò)散, 主要反映在CO2氣腹會增加創(chuàng)口腫瘤細(xì)胞的沾染機(jī)會，其酸性環(huán)境有利于腫瘤細(xì)胞的生長，易引起腹膜、內(nèi)臟缺血，影響機(jī)體免疫力，導(dǎo)致腫瘤擴(kuò)散。CO2氣腹不僅可以影響腹膜及細(xì)胞微環(huán)境，甚至對腫瘤細(xì)胞基因及相關(guān)因子產(chǎn)生影響，最終引起腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲能力的改變。

Beclin1是重要的自噬相關(guān)基因，本課題在CO2處理下，發(fā)現(xiàn)上調(diào)Beclin1基因的過表達(dá)，SKOV3發(fā)生了增殖轉(zhuǎn)移，而抑制Beclin1基因的表達(dá)后，SKOV3細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)移明顯降低，這提示CO2氣腹可能通過上調(diào)Beclin1基因的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，增強(qiáng)了人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3的活力以及抵御不良環(huán)境的能力，從而使細(xì)胞增殖及遷移能力增強(qiáng)，促進(jìn)了卵巢癌的生長和轉(zhuǎn)移。有研究證實(shí)，饑餓狀態(tài)下的卵巢癌SKOV3細(xì)胞能迅速誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，而在使用自噬抑制劑或干擾Beclin1表達(dá)后，卵巢癌細(xì)胞的活力降低，細(xì)胞的生長增殖能力被抑制[7]。Beclin1促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞株 SKOV3的增殖轉(zhuǎn)移可能是因?yàn)镃O2制造的缺氧饑餓環(huán)境，但其發(fā)揮作用的具體機(jī)制還不明確。

早期部分學(xué)者認(rèn)為CO2氣腹有促進(jìn)惡性腫瘤增殖的作用。然而近年來，許多學(xué)者的研究卻得出了相反的結(jié)論，即CO2氣腹環(huán)境對腫瘤細(xì)胞的生長增殖有抑制作用。Cai等[8]在體外研究還發(fā)現(xiàn), 濕潤的CO2可以用來治療和預(yù)防結(jié)腸癌腹腔種植。因此，CO2氣腹對腫瘤細(xì)胞種植和增殖轉(zhuǎn)移的影響不能一概而論，還需要不斷深入研究。