趙惠茹,曹靜思,高 建,靖 會,李璐瑤
(西安醫(yī)學院 藥學院,陜西 西安 710021)
杜仲為杜仲科植物杜仲(EucommiaulmoidesOliv.)的干燥樹皮,具有補肝強腎、強筋健骨、調(diào)理沖任、固經(jīng)安胎等功效[1-2]。杜仲籽為杜仲的翅果籽,杜仲籽油營養(yǎng)成分豐富,含有桃葉珊瑚苷、綠原酸、多聚環(huán)烯醚萜苷、脂肪酸等多種成分[3-5],具有和杜仲類似的功效,主要用于防治腰脊酸疼,風濕痹痛,胎動不安,習慣性流產(chǎn)等,還可清除體內(nèi)垃圾,加強人體細胞生理代謝,防止骨骼老化,平衡人體血壓,是一種很好的功能食品,同時也是生產(chǎn)其他功能食品的良好基料[6-7]?,F(xiàn)階段人們多注重于杜仲皮和杜仲葉的研究開發(fā),對杜仲籽油的開發(fā)利用較少[8-11]。常采用亞臨界流體萃取、水酶法提取或者以石油醚、正己烷為溶劑,超聲波輔助提取,單因素或正交實驗優(yōu)化杜仲籽油提取工藝,雖有簡便、實驗次數(shù)少等優(yōu)點,但精度不高,預測性較差[12-17]。因此,作者采用Box-Behnken設計-效應面法對杜仲籽油提取工藝進行優(yōu)化并對其脂肪酸成分進行分析,以期為杜仲籽油的開發(fā)利用提供依據(jù)。
杜仲籽:產(chǎn)自河北省青縣流河鎮(zhèn)純豐蔬菜良種繁育場,經(jīng)西安醫(yī)學院藥學院邊軍昌老師鑒定為杜仲科植物杜仲EucommiaulmoidesOliv.的翅果籽;水為超純水;其他試劑:均為分析純,市售。
氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀:7890A/5975C,美國Agilent公司;粉碎機:CS-700,山東鼎坤機械有限公司;電子精密天平:FA1004B,上海越平科學儀器有限公司;電熱恒溫鼓風干燥箱:DHG-9240B,上海培因?qū)嶒瀮x器有限公司;智能數(shù)顯恒溫水浴箱:DZKW-D-2,北京市永光明醫(yī)療儀器廠;超聲波清洗器:KQ5200E,昆山市超聲儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:RE-52,上海亞榮生物儀器廠;循環(huán)水式多用真空泵:SHB-Ⅲ,鄭州長城科工貿(mào)有限公司;425 μm標準篩:上海豐行篩網(wǎng)制造有限公司。
1.2.1 杜仲籽油的提取
稱取杜仲籽粉末10 g,以石油醚(60~90 ℃)為提取溶劑,提取溶劑與杜仲籽粉末按照一定的體積質(zhì)量比(mL/g,以下簡稱液料比)、提取時間和提取溫度進行回流提取,抽濾后減壓蒸餾去除溶劑,60 ℃下干燥至質(zhì)量恒定得到杜仲籽油,按照提取率=m(杜仲籽油)/m(杜仲籽粉)×100%計算杜仲籽油出油率。
1.2.2 杜仲籽油的GC-MS分析條件
GC條件:HP-5MS 氣相色譜柱(30 m×250 μm×0.25 μm);載氣為高純氦氣;程序升溫起始溫度50 ℃,保持2 min,再以5 ℃/min 的速度升溫到150 ℃,保持10 min,然后以1 ℃/min 的速度升溫到180 ℃,保持10 min,最后以2 ℃/min的速度升溫到220 ℃,保持19 min;進樣口溫度250 ℃,進樣量1 μL,以分流比20∶1分流進樣;柱流量1 mL/min;溶劑延遲3 min。
MS條件:EI 離子源,全掃描方式,接口溫度 250 ℃,離子源溫度 230 ℃,四級桿溫度150 ℃,電離能量70 eV,質(zhì)量掃描范圍(m/z) 45~450,NIST11標準質(zhì)譜庫。
1.2.3 脂肪酸的甲酯化及組成分析
精密稱取0.1 g杜仲籽油于25 mL圓底燒瓶中,加入2 mL丙酮溶劑使之溶解,再加1 mL甲醇溶液和0.1 mL濃硫酸溶液,置于70 ℃恒溫水浴箱中連續(xù)回流1 h。待冷卻后加入正己烷5 mL,并加蒸餾水5 mL,振蕩使分散均勻,取上清液,再用5 mL正己烷洗滌1次,合并上清液,加入足量的無水硫酸鈉,靜置12 h充分干燥,取上清液,通過0.45 μm有機系微孔濾膜過濾,取濾液1 mL按GC-MS條件分析脂肪酸組成。質(zhì)譜圖經(jīng)解析并與NIST11標準質(zhì)譜庫對照后確定脂肪酸化學結(jié)構(gòu),利用峰面積歸一化法計算各脂肪酸的相對含量。
1.2.4 杜仲籽油提取工藝優(yōu)化
為了考察提取溫度、提取時間、液料比對杜仲籽出油率的影響,在單因素實驗基礎上,應用Design-Expert 8.0.6.1軟件進行三因素三水平實驗設計,Box-Behnken設計-效應面法對杜仲籽出油率的提取工藝進行優(yōu)化。
2.1.1 液料比對杜仲籽出油率的影響
稱取杜仲籽粗粉5 g共5份,分別以液料比4、8、12、16、20 mL/g加入石油醚(60~90 ℃),在水浴溫度為50 ℃條件下提取150 min,按照1.2.1方法計算杜仲籽出油率,結(jié)果見圖1。
液料比/(mL·g-1)圖1 液料比對杜仲籽出油率的影響
由圖1可知,當液料比由4 mL/g增加至8 mL/g時,出油量增長速度較快,繼續(xù)增加至液料比至20 mL/g,出油量增長不明顯。兼顧經(jīng)濟效益節(jié)約溶劑的情況,確定液料比為8 mL/g繼續(xù)進行單因素實驗考察。
2.1.2 提取溫度對杜仲籽出油率的影響
稱取杜仲籽粗粉5 g共5份,以液料比8 mL/g加入石油醚(60~90 ℃),分別在20、35、50、65、80 ℃水浴溫度下提取150 min,按照1.2.1方法計算杜仲籽出油率,結(jié)果見圖2。
t/℃圖2 提取溫度對杜仲籽出油率的影響
由圖2可知,隨著提取溫度的升高傳質(zhì)加快,出油率不斷增大,t=20~50 ℃出油率增長較快,t>50 ℃后出油率增長不顯著,故在進行之后的提取時間單因素實驗時,考慮到溫度太高可能會使杜仲膠溶出增大,確定50 ℃為提取溫度繼續(xù)進行單因素實驗考察。
2.1.3 提取時間對杜仲籽出油率的影響
稱取杜仲籽粗粉5 g共5份,以液料比8 mL/g加入石油醚(60~90 ℃),在50 ℃水浴溫度下分別提取60、90、120、150、180 min,按照1.2.1方法計算杜仲籽出油率,結(jié)果見圖3。
t/min圖3 提取時間對杜仲籽出油率的影響
由圖3可知,隨著提取時間的延長,出油率不斷增大。這是由于在提取初期,原料中油脂含量較高,在溶劑中溶解較快,出油量迅速增加,隨著提取時間延長,原料中油脂含量減少,油脂在溶劑中的飽和度越來越大,因而在溶劑中溶解減慢,出油量增加相應趨緩。
根據(jù)單因素實驗結(jié)果選擇各因素的最佳取值范圍。以杜仲籽出油率為考察指標,液料比(A)、提取溫度(B)、提取時間(C)為實驗因素,各水平設計見表1,效應面法設計及結(jié)果見表2,回歸模型方差分析見表3。
表1 因素各水平的代碼值和實際操作物理量
表2 效應面法實驗設計及結(jié)果
表3 回歸模型方差分析
根據(jù)二次回歸方程中兩兩因素對杜仲籽出油率的影響,分別繪制各個因素的三維效應面圖見圖4~圖6。
由圖4~圖6可知,兩兩因素交互作用對杜仲籽出油率的影響趨勢均較平緩,作用不顯著,這與回歸模型方差分析中的顯著性一致。
圖4 液料比和提取溫度對杜仲籽出油率的影響
圖5 液料比和提取時間對杜仲籽出油率的影響
圖6 提取溫度和提取時間對杜仲籽出油率的影響
由Design Expert 8.0.6軟件分析得最佳提取工藝為液料比14 mL/g,提取溫度35 ℃,提取時間90 min。為了驗證實驗的穩(wěn)定性,根據(jù)優(yōu)化出的最佳提取工藝條件進行實驗,平行做3份,杜仲籽平均出油率為10.96%(RSD為4.82%),預測值為10.03%,結(jié)果表明工藝穩(wěn)定可靠。
應用氣質(zhì)聯(lián)用儀對杜仲籽油脂肪酸組成進行定性和定量分析,經(jīng)譜庫檢索和質(zhì)譜圖解析,見圖7。
t/min圖7 杜仲籽油脂肪酸成分的總離子流圖
由圖7可知,杜仲籽油主要由亞油酸、油酸、棕櫚酸、亞麻酸和硬脂酸等脂肪酸組成,其保留時間分別為12.34、13.90、14.97、15.48和16.78 min,相對含量分別為10.54%、13.89%、5.52%、61.73%、2.17%,杜仲籽油中具有較高食用價值和保健作用的不飽和脂肪酸含量高達88.34%。
通過單因素實驗和Box-Behnken設計-效應面法優(yōu)化杜仲籽油提取工藝為藥材與提取溶劑石油醚(60~90 ℃)液料比14 mL/g,提取溫度35 ℃,提取時間90 min,影響杜仲籽油提取率因素的主次順序依次為液料比>提取溫度>提取時間。在此工藝條件下,杜仲籽出油率為10.96%,實驗精度高,重現(xiàn)性好。GC-MS分析其脂肪酸主要為不飽和脂肪酸,且含量最高的為亞麻酸,可達61.73%,有一些出峰明顯但不屬于脂肪酸的成分經(jīng)過對比后初步鑒定為苯丙素類、木質(zhì)素類以及黃酮類等成分,具體結(jié)構(gòu)的確認有待于進一步研究。