付 強(qiáng)，劉 青，徐興志，王志云，陸偉躍

（1. 浙江華海藥業(yè)股份有限公司，浙江 臺(tái)州 317000； 2. 復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院，上海 201203； 3. 中國(guó)藥科大學(xué)藥物科學(xué)研究院，江蘇 南京 210009）

鹽酸伊立替康注射液由美國(guó)輝瑞制藥公司于1996年研發(fā)上市，常用于治療晚期大腸癌[1-2]，輔料為乳酸和山梨醇，用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 至3.0 ～4.0，目前原研專利已過(guò)期，開(kāi)發(fā)其仿制藥具有巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。仿制、原研注射液的輔料用量差異通常應(yīng)≤5%。本品美國(guó)食品藥物管理局（FDA）說(shuō)明書中規(guī)定乳酸含量為792 ～828 μg/mL（總?cè)樗崃浚⒏?guó)家藥物食品與醫(yī)療技術(shù)管理局說(shuō)明書中規(guī)定乳酸處方量為900 μg/mL（總?cè)樗崃浚?，兩者差異超過(guò)5%。乳酸主要由單乳酸、乳酰乳酸和水組成[3-4]，《中國(guó)藥典》推薦的滴定分析方法僅能測(cè)定乳酸輔料中總?cè)樗崃?，不能確定單乳酸和乳酰乳酸的比例[4]。單乳酸可采用離子色譜法[5-7]、液相色譜法[8 -12]和氣相色譜法[13-15]等方法進(jìn)行含量測(cè)定，但目前乳酰乳酸含量測(cè)定的關(guān)注度較低。本研究中采用仿制藥反向工程研究技術(shù)對(duì)原研藥中乳酸處方量進(jìn)行探討，以確定真實(shí)的乳酸投料量，規(guī)避仿制藥開(kāi)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260 型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司，單波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器）；XS105DU 型電子分析天平（梅特勒-托利多國(guó)際有限公司，十萬(wàn)分之一）；pH 計(jì)（梅特勒-托利多國(guó)際有限公司）；HNS26 型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）；Milli-Q Reference 型超純水儀（默克化工技術(shù)＜上海＞有限公司）。

1.2 試藥

乳酸（無(wú)錫福祈制藥有限公司，含總?cè)樗崃?8.2%）；鹽酸伊立替康注射液（實(shí)驗(yàn)室自制，規(guī)格為每支40mg∶2 mL）；鹽酸伊立替康注射液原研品（美國(guó)輝瑞制藥，規(guī)格為每支40 mg ∶2 mL）；乙腈（美國(guó)Sigma-Aldrich 公司，高效液相色譜）；磷酸二氫鈉和磷酸（比利時(shí)Acros 公司，色譜純）；氫氧化鈉（杭州青辰化學(xué)試劑廠，分析純）；鹽酸（杭州化學(xué)試劑有限公司，分析純）；實(shí)驗(yàn)用水均為Milli-Q 超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量分析

2.1.1 色譜條件

色譜柱：YMC AQ C18耐水色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：20 mmol /L 磷酸二氫鈉緩沖液（流動(dòng)相A，pH 2.5）和乙腈（流動(dòng)相B），梯度洗脫程序見(jiàn)表1，其中28 ～60 min 的洗脫程序可保證除乳酸外其他組分的洗脫；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：205 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2.1.2 溶液制備

對(duì)照品溶液：取乳酸適量，精密稱定，加純化水溶解并制成900 μg/mL 對(duì)照品貯備液，精密移取1 mL，與70 μL 1 mol/L NaOH 混勻，沸水浴加熱15 min，再加170 μL 1 mol/L HCl 調(diào)至酸性，將所有形態(tài)乳酸轉(zhuǎn)化為單乳酸，用流動(dòng)相A 稀釋至約90 μg/mL，即得。

供試品溶液：精密移取1 mL 注射液，與70 μL 1 mol/L NaOH 混合，沸水浴加熱15 min，將所有形態(tài)乳酸轉(zhuǎn)化為乳酸鈉，再加170 μL 1 mol/L HCl 調(diào)至酸性，用流動(dòng)相A 稀釋至總?cè)樗崃考s90 μg/mL，即得供試品溶液Ⅰ。精密移取1 mL 注射液，加流動(dòng)相A 稀釋至約90 μg/mL，即得供試品溶液Ⅱ，乳酰乳酸未受到破壞。

表1 梯度洗脫程序

2.1.3 乳酸及乳酰乳酸確認(rèn)

取同一待測(cè)注射液，按供試品溶液方法制備并進(jìn)樣，即可計(jì)算總?cè)樗崃亢腿轷Ｈ樗岬谋壤?。進(jìn)樣含90 μg/mL 乳酸的供試品溶液Ⅱ，在色譜圖上出現(xiàn)2 個(gè)峰，將流出物進(jìn)行質(zhì)譜確認(rèn)。在電噴霧質(zhì)譜法（ESI-MS）負(fù)離子檢測(cè)模式下，4.3 min 的峰產(chǎn)生m/ z為89.0 的離子，對(duì)應(yīng)乳酸[M-H]-離子，表明該峰為單乳酸；16.6 min的峰產(chǎn)生m/ z為161.0 的離子，對(duì)應(yīng)乳酰乳酸[M-H]-離子，表明該峰為乳酰乳酸。典型色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 典型色譜圖

2.1.4 方法學(xué)考察

專屬性考察：采用DAD 檢測(cè)器，在190 ～400 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)，分別進(jìn)樣稀釋液（流動(dòng)相A）、供試品溶液Ⅰ、供試品溶液Ⅱ和鹽酸伊立替康注射液各組分溶液各20 μL。結(jié)果單乳酸和乳酰乳酸色譜峰是純的，其他組分與單乳酸和乳酰乳酸峰的分離度均遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于1.5，表明方法專屬性良好。

線性關(guān)系考察：分別配制45，72，90，135，180 μg/mL對(duì)照品溶液各3 份，各進(jìn)樣20 μL，以乳酸質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、乳酸平均峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程Y=851.712 4X+864.974 5，R2=0.999 9。結(jié)果表明，乳酸質(zhì)量濃度在45 ～180 μg/mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好（R2≥0.999）。

檢測(cè)限和定量限確定：適當(dāng)稀釋40.13 μg/mL 對(duì)照品溶液并連續(xù)進(jìn)樣60 μL，確定方法的檢測(cè)限[信噪比（S/N）約為3]和定量限（S/N約為10）分別約為0.54 μg/mL 和1.63 μg/mL。

精密度考察：平行制備6 份供試品溶液Ⅰ和供試品溶液Ⅱ，各進(jìn)樣20 μL。結(jié)果的RSD≤1.21%（n=6），表明儀器精密度良好（≤2.0%）。

準(zhǔn)確度考察：分別稱取各組分，制成含有45，90，180 μg / mL 乳酸的供試品溶液Ⅰ，每個(gè)質(zhì)量濃度水平平行配制3 份，各進(jìn)樣20 μL。結(jié)果平均回收率為101.0% ～101.7% ，表明方法準(zhǔn)確度良好（98.0% ～102.0%）。

乳酸溶液穩(wěn)定性：取供試品溶液Ⅱ，室溫保存，于0，8，40，50 h 時(shí)進(jìn)樣，考察乳酸含量。結(jié)果單乳酸和乳酰乳酸峰面積的RSD≤0.9%，表明乳酸供試品溶液Ⅱ中單乳酸和乳酰乳酸在50 h 內(nèi)不會(huì)發(fā)生明顯的相互轉(zhuǎn)化。

2.2 制劑中乳酸含量檢測(cè)

鹽酸伊立替康在水溶液中溶解度小于10 mg/mL，但能以20 mg/mL 的質(zhì)量濃度形成穩(wěn)定的交聯(lián)物[16]。乳酸為穩(wěn)定劑，其處方量的不確定進(jìn)一步增加了仿制藥開(kāi)發(fā)難度和穩(wěn)定性試驗(yàn)風(fēng)險(xiǎn)。取原研藥，制成供試品溶液Ⅰ和供試品溶液Ⅱ各2 份，每份進(jìn)樣40 μL，測(cè)得原研藥總?cè)樗崞骄繛?07 μg/mL，符合《美國(guó)藥典》（USP）質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的乳酸輔料含有88% ～92%的總?cè)樗?。FDA說(shuō)明書規(guī)定，每1 mL 藥液中加入0.9 mg 符合USP 標(biāo)準(zhǔn)的乳酸輔料，即相當(dāng)于總?cè)樗崃?.792 ～0.837 μg/mL。原研藥總?cè)樗崞骄吭谏鲜龇秶鷥?nèi)，表明本品乳酸輔料按FDA 說(shuō)明書投料。

2.3 制劑中乳酰乳酸含量差異分析

對(duì)實(shí)驗(yàn)室自制藥和原研藥進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)自制藥與原研藥乳酰乳酸與單乳酸的峰面積比分別為17.53%和4.23%，表明自制藥與原研藥單乳酸和乳酰乳酸含量存在明顯差異。若乳酸或乳酰乳酸對(duì)藥物穩(wěn)定性有不同影響，區(qū)分單乳酸和乳酰乳酸的量將是一個(gè)重要的質(zhì)量控制指標(biāo)。

3 討論

目前，2015 年版《中國(guó)藥典（二部）》推薦的乳酸含量控制方法為滴定法[3-4]，首先使用過(guò)量氫氧化鈉將乳酸全部轉(zhuǎn)化為乳酸鈉，再用鹽酸滴定多余的氫氧化鈉，但此法僅能檢測(cè)總?cè)樗崃浚荒軈^(qū)分單乳酸和乳酰乳酸比例。

本研究中開(kāi)發(fā)了HPLC-UV 法，既能確定鹽酸伊立替康注射液中總?cè)樗崃?，也能測(cè)定單乳酸和乳酰乳酸比例。通過(guò)乳酸溶液直接進(jìn)樣測(cè)定單乳酸的含量，在堿性條件下加熱破壞乳酰乳酸可測(cè)定總?cè)樗崃?，專屬性、精密度、?zhǔn)確度和溶液穩(wěn)定性均良好。對(duì)原研藥的反向工程研究結(jié)果顯示，原研藥乳酸用量在FDA 說(shuō)明書規(guī)定范圍內(nèi)，但原研藥中檢測(cè)到的乳酰乳酸含量?jī)H為自制藥的25%，因此推測(cè)自制用乳酸輔料的乳酰乳酸含量偏高。通過(guò)對(duì)鹽酸伊立替康注射液中乳酸輔料進(jìn)行反向工程研究，確定了原研乳酸處方量，以及自制藥與原研藥乳酰乳酸含量差異，保證自制藥的一致性。反向工程研究在仿制藥開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用，對(duì)于保證產(chǎn)品一致性、提高仿制藥質(zhì)量具有重要意義。