賈明良，方荷芳，李同建，文鋒，韓興杰，金洪光，徐玲玲，廖亮

(九江學(xué)院藥學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，江西 九江 332000)

三葉木通[Akebiatrifoliate(Thunb.) Koidz.]為木通科(Lardizabalaceae)木通屬(AkebiaDecne.)藤本植物，以其藤莖入藥，具有利尿通淋、清心除煩、通經(jīng)下乳功效[1]。此外，三葉木通作為一種新型水果資源也逐漸受到重視，其果肉清甜可口，可鮮食，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值[2]，進(jìn)一步深加工可制作果汁[3]、果酒[4]、果茶[5]、果脯[6]等產(chǎn)品。三葉木通種質(zhì)資源的開發(fā)利用已有報(bào)道，如利用野生資源進(jìn)行馴化及進(jìn)一步人工栽培[7-8]。對不同種質(zhì)資源的繁殖方式也有研究，如利用種子進(jìn)行播種繁殖[9]，利用枝條進(jìn)行扦插繁殖[10-13]等。種子繁殖容易產(chǎn)生性狀分離，扦插繁殖系數(shù)相對較低且不利于進(jìn)一步的品系改良，因此，有學(xué)者進(jìn)行了三葉木通的植物組織培養(yǎng)研究，如沈國林等[14]比較了不同外植體、培養(yǎng)基、pH、溫度、光照、植物生長物質(zhì)種類及其配比等對三葉木通愈傷組織誘導(dǎo)的影響；劉香[15]研究發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)?shù)某暡ㄌ幚砜纱龠M(jìn)三葉木通愈傷組織的誘導(dǎo)；黎世齡等[16]則對三葉木通胚乳進(jìn)行了愈傷組織的誘導(dǎo)研究。以上研究均集中在愈傷組織的誘導(dǎo)上，并未進(jìn)一步誘導(dǎo)產(chǎn)生胚狀體或叢生芽。除了愈傷組織誘導(dǎo)以外，蘇慧慧等[17]以下胚軸為外植體誘導(dǎo)愈傷，進(jìn)一步研究了愈傷組織的再分化及褐化抑制；石小兵等[18]以種子為外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽，然后再利用秋水仙素進(jìn)行染色體加倍得到多倍體。以上研究雖得到了叢生芽，但外植體類型為下胚軸或是種子，來源受到季節(jié)的限制。本文利用來源廣泛的幼嫩枝條及葉片為外植體，對三葉木通無菌外植體獲得、愈傷誘導(dǎo)以及胚狀體誘導(dǎo)等過程進(jìn)行了研究，同時(shí)分析了愈傷組織褐化的主要影響因素，以期建立三葉木通組織培養(yǎng)體系，為三葉木通優(yōu)良品系擴(kuò)繁及進(jìn)一步的品系改良和遺傳轉(zhuǎn)化提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用材料來自江西省九江市九江學(xué)院木通種質(zhì)資源圃栽培基地，以選育的三葉木通優(yōu)良品系幼嫩莖段、葉片為外植體，莖段選取尚未木質(zhì)化的幼嫩枝條，葉片則選用剛展開的幼嫩葉片，取材時(shí)間避開連續(xù)陰雨天，選擇晴朗的上午，取材后將材料置于采樣袋內(nèi)，噴水保濕，盡快帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1無菌外植體獲取及接種前浸泡對褐化的影響 采用幼嫩的莖段及葉片為外植體，流水沖洗后，在超凈工作臺(tái)中用75%酒精消毒1 min，然后無菌水沖洗3次，再利用0.1%的氯化汞水溶液(升汞)進(jìn)行滅菌處理，處理時(shí)間梯度設(shè)置為3、5、8、12、15 min，隨后無菌水沖洗5次以洗凈升汞殘留，置于無菌瓶中待用。

將滅菌后的幼嫩莖段切割為長度0.5 cm左右，葉片則切割為0.5 cm2大小進(jìn)行接種，接種至培養(yǎng)基MS+2,4-D 1.0 mg·L-1+蔗糖30.0 g·L-1+瓊脂6.0 g·L-1中，每瓶接種5個(gè)外植體，每個(gè)處理接種6瓶，于培養(yǎng)室中培養(yǎng)20 d后，記錄污染率、褐化率等生長情況。培養(yǎng)條件為：光照強(qiáng)度 1 500～2 000 lx，每天光照時(shí)間為12 h，溫度(25±1)℃。

選擇合適的滅菌處理，先將切割后的莖段及葉片在無菌水中浸泡3 min，再接種到培養(yǎng)基上，考察浸泡處理對褐化的影響。

1.2.2外植體愈傷組織誘導(dǎo) 表面滅菌處理后的幼嫩莖段切割為0.5 cm左右長，葉片切割為0.5 cm2大小，接種至添加不同濃度的2,4-D(0.2、0.4、1.0 mg·L-1)和NAA(1.0、2.0、4.0 mg·L-1)的MS培養(yǎng)基中，以不加激素的MS培養(yǎng)基為對照。每瓶接種5個(gè)外植體，每個(gè)處理接種6瓶，于培養(yǎng)室中培養(yǎng)20 d后，記錄愈傷組織的誘導(dǎo)率、褐化率等生長情況。培養(yǎng)條件為：光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx，每天光照時(shí)間12 h，溫度(25±1)℃。

1.2.3培養(yǎng)方式對外植體誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)褐化的抑制效果 以褐化嚴(yán)重的幼嫩莖段為外植體，考察固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)兩種培養(yǎng)方式，分別添加不同濃度活性炭(activated carbon，AC)，在見光、避光兩種培養(yǎng)條件下對外植體誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)褐化的抑制效果進(jìn)行研究。固體培養(yǎng)添加瓊脂6.0 g·L-1，液體則不添加瓊脂；AC濃度設(shè)定為0、0.1、0.5、1.0、2.0、3.0 g·L-1。見光培養(yǎng)時(shí)光照強(qiáng)度 1 500～2 000 lx，每天光照時(shí)間12 h，避光培養(yǎng)除遮蔽光照外其余同光照培養(yǎng)。每瓶接種5個(gè)外植體，每個(gè)處理接種6瓶，培養(yǎng)20 d后，記錄愈傷組織誘導(dǎo)率、褐化率等數(shù)據(jù)。

1.2.4愈傷組織再分化誘導(dǎo)胚狀體 將已誘導(dǎo)出來的愈傷組織，接種至添加不同濃度的6-BA(0.2、0.4、1.0 mg·L-1)和NAA(1.0、2.0、4.0 mg·L-1)的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)60 d，觀察記錄胚狀體誘導(dǎo)率及褐化率等數(shù)據(jù)。培養(yǎng)條件為：光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx，每天光照時(shí)間12 h，溫度(25±1)℃。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007、SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體處理方式對愈傷組織誘導(dǎo)和褐化的影響

2.1.1適宜外植體的表面滅菌處理方法 對幼嫩莖段及葉片滅菌處理后接種培養(yǎng)，污染和褐化情況見表1。由表1可以看出，隨著升汞滅菌時(shí)間的延長，莖段和葉片外植體的污染率均逐漸降低，而褐化率則由于升汞的毒害而逐漸升高。對比莖段和葉片外植體，在相同的滅菌強(qiáng)度下，葉片外植體的污染率和褐化率均較低。因此，葉片為三葉木通愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)優(yōu)先選用的外植體。綜合考慮污染和褐化的情況，莖段和葉片合適的滅菌處理組合為：75%乙醇消毒1 min，然后升汞滅菌12 min，并用無菌水沖洗干凈升汞殘留后接種。此時(shí)雖然污染率不是最低，但是褐化情況較低，為合適的滅菌組合。

表1 滅菌條件對無菌外植體獲取的影響Table 1 Effect of sterilization conditions on the acquisition of sterile explants

2.1.2浸泡處理對愈傷組織褐化的抑制效果 接種前進(jìn)行浸泡處理對褐化的影響結(jié)果如表2所示?？梢钥闯觯粶缇幚硐?，不管是莖段還是葉片，接種前通過浸泡處理3 min后，均可降低褐化情況的產(chǎn)生。在浸泡后，可發(fā)現(xiàn)無菌水由無色透明變?yōu)椴枭?/p>

表2 接種前浸泡處理對外植體褐化的影響Table 2 Effect of immersion treatment before inoculation on the browning of explants

2.2 莖段及葉片外植體的愈傷組織誘導(dǎo)

不同激素配比下，莖段及葉片愈傷組織的誘導(dǎo)情況如表3所示。從表3可以看出，在不添加任何激素的A1培養(yǎng)基中，莖段和葉片均無愈傷組織產(chǎn)生。莖段愈傷的誘導(dǎo)在A7培養(yǎng)基內(nèi)可以達(dá)到92.00%的誘導(dǎo)率，顯著高于其他培養(yǎng)基。因此，選取A7為莖段愈傷組織的適宜誘導(dǎo)培養(yǎng)基，即為MS+NAA 0.4 mg·L-1+2,4-D 4.0 mg·L-1+蔗糖30.0 g·L-1+瓊脂6.0 g·L-1，pH5.8。葉片愈傷誘導(dǎo)在A9培養(yǎng)基內(nèi)誘導(dǎo)率最高，達(dá)到97.53%，應(yīng)為葉片誘導(dǎo)愈傷組織的適宜培養(yǎng)基：MS+NAA 1.0 mg·L-1+2,4-D 2.0 mg·L-1+蔗糖30.0 g·L-1+瓊脂6.0 g·L-1，pH5.8。此外，在A5及A6培養(yǎng)基上的愈傷組織誘導(dǎo)率也分別達(dá)到了94.43%和91.00%，也可作為備選培養(yǎng)基類型。

表3 不同激素配比對莖段及葉片愈傷誘導(dǎo)的影響Table 3 Effect of different hormone combinations on callus induction with stem and leaf

2.3 不同處理對外植體誘導(dǎo)愈傷時(shí)褐化的抑制效果

兩種培養(yǎng)方式對外植體誘導(dǎo)愈傷時(shí)褐化的抑制效果見表4。固體培養(yǎng)條件下，見光及避光培養(yǎng)時(shí)，活性炭(AC)濃度的變化對愈傷的誘導(dǎo)有一定的影響。AC濃度在0～1.0 g·L-1時(shí)，愈傷誘導(dǎo)率雖有差異，但都在80%以上。以褐化率為標(biāo)準(zhǔn)，在見光培養(yǎng)時(shí)，AC濃度在1.0 g·L-1時(shí)最低，為7.33%；而避光培養(yǎng)時(shí)，在AC濃度在1.0 g·L-1時(shí)最低，為7.00%。橫向比較見光及避光條件下的褐化情況，可以看出，在相同條件下，避光培養(yǎng)可以在一定程度上降低褐化的發(fā)生。由表4可以看出，液體培養(yǎng)時(shí)，不管是見光還是避光，不論在何種AC濃度情況下均不能誘導(dǎo)愈傷組織，所有的外植體均逐漸死亡?？梢?，液體培養(yǎng)不適合三葉木通莖段外植體的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)。

結(jié)合2.1及2.2的結(jié)果綜合考慮，可將外植體先用無菌水浸泡3 min，然后接種至MS+NAA 0.4 mg·L-1+2,4-D 4.0 mg·L-1+AC 1.0 g·L-1+蔗糖30.0 g·L-1+瓊脂6.0 g·L-1的培養(yǎng)基中進(jìn)行避光培養(yǎng)來誘導(dǎo)愈傷組織。

2.4 愈傷再分化誘導(dǎo)胚狀體

將試驗(yàn)得到的愈傷組織接種至添加不同濃度的6-BA和NAA的MS培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)再分化，結(jié)果見表5。從胚狀體誘導(dǎo)情況來看，誘導(dǎo)率較高的培養(yǎng)基為B5，雖顯著高于其他培養(yǎng)基，但也只有15.33%。其余的培養(yǎng)基類型條件下，則更低。誘導(dǎo)率雖低，但由于胚性愈傷組織可接種至相同培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖，因此，只要誘導(dǎo)得到胚狀體即可進(jìn)一步誘導(dǎo)成苗。因此，各處理中較好的胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+NAA 0.4 mg·L-1+6-BA 2.0 mg·L-1+蔗糖30.0 g·L-1+瓊脂6.0 g·L-1，pH5.8。從褐化率看，各培養(yǎng)基中褐化率都沒有顯著差異，且都較高，但低于見光培養(yǎng)和不加活性炭處理時(shí)100%褐化的情況。因此，前述外植體誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)得到的褐化抑制的條件應(yīng)用至愈傷組織增殖及胚狀體誘導(dǎo)時(shí)，還需進(jìn)一步進(jìn)行優(yōu)化。

誘導(dǎo)得到的胚性愈傷組織接種至胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基，并不斷去除褐化及生長不良的的組織后可得到生長較好的胚狀體。由于每個(gè)胚狀體為一個(gè)完整植物的雛形，將其挑出接種至不含激素的MS培養(yǎng)基中，可生長得到一棵完整的種苗。

表4 不同培養(yǎng)條件對愈傷誘導(dǎo)及褐化的影響Table 4 Effect of different culture conditions on callus induction and browning (%)

表5 激素配比對胚狀體誘導(dǎo)的影響Table 5 Effect of hormone combinations on induction of embryos

圖1 三葉木通胚狀體誘導(dǎo)及成苗Fig.1 Somatic embryo induction and seedling formation of Akebia trifoliate (Thunb.) Koidz.

3 討論

本研究首先得出了合適的外植體滅菌條件，在接種前將外植體于無菌水中浸泡處理3 min，可顯著降低褐化情況的產(chǎn)生，并且可觀察到無菌水由無色透明狀態(tài)變?yōu)椴枭?。分析原因可能是浸泡有利于產(chǎn)生褐化的酚類化合物的溶出[19]。對不同激素條件下愈傷誘導(dǎo)的研究表明，莖段愈傷誘導(dǎo)時(shí)合適的激素配比為NAA 0.4 mg·L-1+2,4-D 4.0 mg·L-1；葉片愈傷誘導(dǎo)時(shí)，合適的激素配比為NAA 1.0 mg·L-1+2,4-D 2.0 mg·L-1?？梢姡线m的NAA和2,4-D濃度有利于愈傷組織的誘導(dǎo)，這與沈國林等[14]的研究結(jié)果一致。

一般而言，避光培養(yǎng)以及添加活性炭可在一定程度上降低褐化的發(fā)生[20-21]，這一結(jié)論在本研究中也得到了驗(yàn)證，三葉木通愈傷誘導(dǎo)時(shí)，合適的活性炭添加濃度為1.0 g·L-1。在考察褐化抑制常用的液體培養(yǎng)方式時(shí)發(fā)現(xiàn)，接種的所有外植體均死亡，這與張小紅等[22]及唐利球等[23]的研究結(jié)果不同，分析原因可能是不同種類植物基因型差異所致。利用得到的愈傷組織接種至MS+NAA 0.4 mg·L-1+6-BA 2.0 mg·L-1+蔗糖30.0 g·L-1+瓊脂6.0 g·L-1培養(yǎng)基中可誘導(dǎo)得到胚狀體狀態(tài)的叢生芽，但誘導(dǎo)率較低，且褐化嚴(yán)重。分析原因可能是三葉木通愈傷組織脫分化后再分化比較困難[14-16]。目前，得到叢生芽的研究也只集中在以種子或下胚軸為外植體上[17-18]，因此，三葉木通愈傷組織的再分化條件還需要進(jìn)一步的優(yōu)化研究。