王夢閣, 吳英, 程安春, 汪銘書, 朱德康, 賈仁勇, 劉馬峰,陳舜, 趙新新, 楊喬, 張沙秋, 黃娟, 劉韻雅, 張玲, 于艷玲

(四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院禽病防治研究中心, 預防獸醫(yī)研究所, 動物疫病與人類健康四川省重點實驗室, 成都 611130)

家禽生產(chǎn)是畜牧業(yè)中增長最快的產(chǎn)業(yè)之一，每十年以25%的速度增長。禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)、新城疫病毒(newcastle disease virus,NDV)、馬立克氏病毒(Marek’s diseas virus，MDV)、傳染性喉氣管炎病毒(nfectious laryngotracheitis virus，ILTV)、傳染性法氏囊病毒(infectious bursal disease virus, IBDV)、鴨腸炎病毒(duck enteritis virus，DEV)、鴨甲肝病毒(duck hepatitis A virus，DHAV)、鴨黃病毒(duck flavivirus)等，是目前危害養(yǎng)禽業(yè)的幾種常見病毒病，感染后的肉蛋禽死亡率高、飼料報酬增高，種禽產(chǎn)蛋下降等現(xiàn)象在臨床上屢見不鮮。對于這些病毒性疾病而言，往往無特效治療藥物，一旦發(fā)病后的治療效果都不甚理想，其防控主要依賴于疫苗接種。目前針對上述禽病毒性疾病的主要疫苗種類包括滅活疫苗和弱毒活疫苗。滅活疫苗使用安全，不會造成病毒的擴散，耗時少，但免疫效果往往不夠理想且需要多次免疫才能有較好效果，此外還必需添加佐劑，成本較高。弱毒疫苗比滅活苗產(chǎn)生免疫力快，但存在病毒毒力返強的潛在風險[1]。相比而言，隨著基因工程技術的發(fā)展，能夠同時表達多種外源基因的新型病毒活載體疫苗逐漸成為當前疫苗開發(fā)的主要方向。

新型病毒活載體疫苗是用基因工程技術將病毒 (常為疫苗弱毒株)構建成一個載體(或稱外源基因攜帶者)，把外源基因(包括重組多肽、肽鏈抗原位點等)插入其中使之表達的活疫苗[2]。該類疫苗通過向宿主免疫系統(tǒng)提交免疫原性蛋白的方式免疫動物，與自然感染時的真實情況很接近，可誘導產(chǎn)生的免疫比較廣泛，包括體液免疫和細胞免疫，甚至黏膜免疫[3]，同時具備活疫苗的免疫效力高、成本低及滅活疫苗的安全性好等優(yōu)點。且多個外源基因同時表達，可以達到一針防多病的目的，不僅節(jié)約了大量的人力物力，減輕了動物的應激反應，而且能夠很好地解決臨床上多種病毒性疾病混合感染和抗原變異導致單一疫苗免疫失敗的情況，顯示出良好的應用前景。

1 病毒活載體疫苗概述

疫苗的研發(fā)是一個復雜而系統(tǒng)的工程，一支疫苗從研發(fā)到上市至少需要8～20年的時間?，F(xiàn)在疫苗的類型主要包括傳統(tǒng)疫苗和新型疫苗。新型疫苗包括亞單位疫苗、基因工程苗、抗獨特型抗體、合成肽苗等，活載體疫苗是近幾年來發(fā)展起來的新型基因工程疫苗，主要應用于動物細菌和病毒性傳染病疫苗的改造和多價疫苗研制，以預防抗原變異和混合感染的發(fā)生。目前，腺病毒活載體疫苗應用最廣泛，已被應用于呈遞外源基因并在細胞中大量表達外源基因，刺激機體產(chǎn)生廣泛的體液免疫和細胞免疫。除腺病毒之外，痘病毒也是疫苗平臺開發(fā)中常用的載體疫苗之一，這在很大程度上歸功于廣泛而成功的天花疫苗(和相關改良的安卡拉痘苗)的開發(fā)和使用，從而為人類提供了對于痘病毒特性和安全的認識，包括：插入外源基因的大基因容量、病毒對哺乳動物細胞的廣泛趨向性、抗原的短時間生產(chǎn)和病毒在細胞質(zhì)中的定位。桿狀病毒是表達外源蛋白的有效工具，可以表達高質(zhì)量的重組蛋白。同時攜帶哺乳動物細胞活性啟動子的桿狀病毒，能夠在各種哺乳動物中轉移和表達外源基因。

經(jīng)濟、方便在疫苗研發(fā)中也同樣重要。新城疫病毒基因組小，易于操作，含有可修飾的模塊化基因組，可以適應外源的遺傳信息；新城疫重組病毒遺傳性質(zhì)穩(wěn)定，可通過飲水、滴鼻、氣霧進行免疫。偽狂犬病毒屬于皰疹病毒科(Herpesviridae)，感染性良好，具有大量的非必需基因，可以插入外源基因，同樣具有作為載體疫苗的優(yōu)勢；偽狂犬病疫苗具有良好的抗原性，缺失非必需基因后插入外源基因構建的重組病毒，可以作為兩種甚至多種疫病的標記疫苗?？袢〔《竞退菪钥谘撞《緦儆趶棤畈《究?Rhabdoviridae)，他們的基因組遺傳性穩(wěn)定，易于遺傳操作。由于彈狀病毒科病毒基因組整合到宿主基因組中不會發(fā)生重組、逆轉，因此許多外源基因已被插入基于彈狀病毒的載體并成功表達。

2 禽皰疹病毒載體疫苗預防禽病毒性疾病的優(yōu)勢與缺陷

在過去的研究中，貓皰疹病毒(feline herpes virus，F(xiàn)HV)、新城疫病毒、傳染性喉氣管炎病毒、鴨腸炎病毒、馬立克氏病病毒、火雞皰疹病毒(turkey herpes virus，HVT)、痘病毒(pox virus)、腺病毒(adenovirus)、脊髓灰質(zhì)炎病毒(poliovirus)、流感病毒(influenza virus)等都曾被用于作為載體開發(fā)預防禽病毒性疾病的爆發(fā)。相比之下，以雞馬立克氏病毒、傳染性喉氣管炎病毒和鴨腸炎病毒為代表的禽皰疹病毒，在作為抵抗禽病毒性疾病疫苗的載體開發(fā)方面具有諸多優(yōu)勢。皰疹病毒家族成員的基因組龐大，約150 kb左右，預計有約70～80個編碼基因，其中至少有20%的基因是非必需的，可容納多個外源基因的同時插入，且其宿主譜窄，免疫動物后不容易產(chǎn)生流行病學方面的不良后果。同時因其病毒表面具有囊膜，作為載體容易表達表面糖蛋白，誘發(fā)體液免疫和細胞免疫。由于許多皰疹病毒經(jīng)粘膜途徑感染，構建的載體活疫苗也可經(jīng)黏膜途徑遞呈抗原，誘導特異性黏膜免疫[4]。與傳統(tǒng)疫苗相比，禽皰疹病毒活載體疫苗具有以下優(yōu)點：第一、生產(chǎn)成本低，可廉價、大批地生產(chǎn)；第二、易于區(qū)分感染動物和免疫動物[5]，由于活載體疫苗中只含有外源抗原的蛋白成份，或者缺失某一蛋白成份，因此可通過檢測野毒株和活載體疫苗中是否存在病毒蛋白的抗體，從而區(qū)分野毒感染者和免疫動物；第三、利用活載體可制成多價疫苗，達到一針防多病的目的。理論上許多病毒載體的基因組可缺失、插入或直接修飾，但臨床應用上遺傳性質(zhì)并不一定穩(wěn)定，在構建重組病毒疫苗前應評估其潛在風險。盡管火雞皰疹病毒、鴨腸炎病毒已被大量用于活載體疫苗研究，當動物初次免疫后再免疫時，機體還有可能產(chǎn)生對活載體的免疫排斥[6]、其他類型疫苗對活載體疫苗的影響、疫苗針對靶動物的局限性等多種限制因素。值得注意的是，減毒皰疹病毒疫苗可能重組形成強毒的野毒病毒，毒力返強帶來嚴重后果[7]。

3 禽皰疹病毒活載體疫苗的構建

3.1 重組活載體疫苗基本原理

重組活載體疫苗通常是以動物病原弱毒或無毒株為載體，通過同源重組(homologous recombination，HR)、Fosmid多片段拯救系統(tǒng)、細菌人工染色體(bacterial artificial chromosome, BAC)、CRISPR/Cas9系統(tǒng)等基因編輯技術操控病毒載體基因組，插入并表達外源抗原基因，但該載體病毒的生存與繁殖不受影響，且能誘導機體的體液免疫和細胞免疫。接種這種重組疫苗以后，不僅能對原病毒產(chǎn)生保護力，還獲得對插入基因相關疾病的保護力[8]；同時，一個載體可以表達多個免疫基因，可獲得多價苗或多聯(lián)疫苗。構建重組病毒首先必需進行病毒復制非必需區(qū)篩選，將外源基因插入到病毒復制非必需區(qū)，才能不影響病毒的復制。有些基因雖然為非編碼區(qū)，但選擇其作為插入位點將影響親本株的復制能力及重組病毒的免疫效力，因此應嚴格選擇插入位點。其次，應考慮外源基因的表達能力，包括啟動子、增強子、起始密碼子和終止密碼子等因素。為了提高外源基因表達量，一般使用表達能力較強的啟動子，如CMV、SV40等。

3.2 禽皰疹病毒載體的構建方法

3.2.1同源重組 基因的同源重組是較普遍的生物學現(xiàn)象，從噬菌體、細菌到真核生物都有存在[9]。Li和Elledge[10]在2005年首次報道了一種快速構建重組DNA分子的體內(nèi)克隆基因的方法——MAGIC。該方法利用細菌接合轉移，將攜帶目的片段的供體質(zhì)粒和攜帶受體質(zhì)粒的細菌進行交配，在同一個細胞內(nèi)，供體和受體質(zhì)粒經(jīng)核酸內(nèi)切酶I-SceI各自消化成兩個線性化片段，從而進行同源重組。MAGIC法適用于全基因組的同源重組，通過構建含有插入位點左右兩側同源臂的轉移載體質(zhì)粒，將目的序列插入到病毒的基因組中，轉移載體包括篩選標記，從而區(qū)分野毒株與重組病毒;也同樣適用于BAC、CRISPR/Cas9系統(tǒng)構建重組病毒。

3.2.2細菌人工染色體 由于禽皰疹病毒基因組龐大，在其基礎上運用傳統(tǒng)的同源重組方法進行改造費時費力。近年來隨著分子生物學技術的發(fā)展，利用BAC技術，通過同源重組將BAC載體功能序列mini-F插入到禽皰疹病毒基因組中的某個位點，用有限稀釋和嗜斑純化的方法將帶有篩選標記的重組病毒純化出來，最后用電轉化方法轉入E.coli，以獲得全基因組感染性克隆[11]。同時可用Red重組在細菌內(nèi)對感染性克隆進行操控，將改造后的感染性克隆全基因組轉染宿主細胞內(nèi)進行拯救，獲得插入外源基因的重組病毒。用BAC法拯救出來的病毒不含有野毒，經(jīng)過多次傳代后也未出現(xiàn)。

3.2.3Fosmid多片段拯救系統(tǒng) Fosmid載體是含有大腸桿菌 F-因子的粘粒(cosmid)，既具有粘粒載體增殖與包裝效率高的優(yōu)點，又具有大腸桿菌 F-因子單拷貝、穩(wěn)定性高的特性[12]。構建Fosmid基因文庫的方法是通過物理方法隨機剪切病毒基因組DNA，經(jīng)末端補平后與平末端的Fosmid載體連接，構建不具有偏向性的基因組文庫，構建好之后可以在大腸桿菌中復制和保存。外源基因在細菌內(nèi)通過基因編輯技術將基因插到全病毒基因組的Fosmid粘粒，通過提取質(zhì)粒將病毒拯救從而獲得大量重組病毒，這種方法比BAC更穩(wěn)定、更便利。

3.2.4CRISPR/Cas9系統(tǒng) 常規(guī)疫苗一般是通過同源重組或BAC技術產(chǎn)生的，但生產(chǎn)這種疫苗需要重新構建轉移載體和多輪蝕斑純化才能獲得重組病毒。CRISPR/Cas系統(tǒng)是一種微生物針對入侵病毒和其他遺傳因素的天然免疫機制，Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)常用于真核細胞中的基因編輯。CRISPR/Cas9系統(tǒng)是在Cas9內(nèi)切酶作用下切割雙鏈DNA進行基因敲入的，且有一段高度同源的DNA修復模板(供體模板)存在時，在生物體內(nèi)啟動同源定向修復路徑，將一段外源DNA定點插入基因內(nèi)部，從而準確有效地進行基因編輯。CRISPR/Cas9系統(tǒng)在高效生產(chǎn)轉基因細胞和動物模型方面取得了巨大成功，已被用于操縱幾種大型DNA病毒的基因組，包括Ⅰ型單純皰疹病毒、腺病毒、偽狂犬病病毒、牛痘病毒、愛潑斯坦-巴爾病毒、豚鼠巨細胞病毒和鴨腸炎病毒。

3.3 外源基因在禽皰疹病毒活載體疫苗中的表達及評價

在構建重組病毒活載體疫苗中，外源基因表達能力是研究重組疫苗的一個關鍵因素。近年來，以火雞皰疹病毒作為載體成功表達了多種禽病毒保護性抗原基因，包括雞傳染性喉氣管炎病毒的gB基因[13]、傳染性法氏囊病毒的VP2基因[14]和禽流感病毒的HA基因[15]，以雞傳染性喉氣管炎病毒為載體表達禽流感病毒的HA基因[16]，以鴨腸炎病毒為載體表達禽流感病毒HA基因[17-23]，雞傳染性喉氣管炎病毒N、S、S1基因[24]，共表達鴨坦布蘇病毒PrM基因和高致病性禽流感HA基因[17]，鴨肝炎Ⅰ型和Ⅲ型病毒的VP1基因[25]。同個載體中表達多個外源基因，應優(yōu)先考慮真核表達載體的選擇，有效的轉錄起始是外源基因能否在宿主細胞中高效表達的關鍵步驟之一[26]。鴨瘟-鴨肝炎重組病毒的鴨肝炎Ⅰ型和Ⅲ型VP1基因串聯(lián)表達，是通過在真核表達載體中兩個VP1間加入2A切割元件，切割效率達90%，有利于不同血清型VP1抗原的表達。也有學者把Ⅰ型VP1插入鴨瘟病毒基因組并成功表達，但在動物攻毒保護試驗中免疫效果不好，可能跟VP1基因插入位點有關。除串聯(lián)表達之外，也可選同一載體的不同插入位點來表達兩個或兩個以上的外源基因，鴨坦布蘇病毒PrM基因和高致病性禽流感HA基因分別插入鴨瘟病毒基因US7和US8、UL26和UL27之間來實現(xiàn)共表達。為驗證外源基因是否能成功表達，需通過體外和體內(nèi)試驗進行檢測。體外試驗通過免疫印跡、間接免疫熒光試驗驗證外源蛋白的表達，體內(nèi)實驗可檢測攻毒后產(chǎn)生中和抗體水平、細胞免疫、體液免疫、半數(shù)致死量等多方面進行評價。體外和體內(nèi)試驗驗證外源基因是否成功表達缺一不可，觀察活載體疫苗保護率是評估疫苗效果的重要指標。除此之外，評價活載體疫苗對宿主存在潛在的安全性風險，應考慮以下幾點因素：第一、選擇針對某種或某些病原合適的活載體；第二、外源基因插入載體適當?shù)奈恢貌⒛軌蚍€(wěn)定地表達外源抗原并將其呈遞到恰當?shù)牟课?，刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生相應的免疫反應；第三、不同的疫苗免疫策略同樣也會影響疫苗的效果與安全性，其免疫日齡、免疫方式、免疫間隔時間、免疫劑量和幾種疫苗聯(lián)合使用是評估疫苗的主要程序。

3.4 禽皰疹病毒重組載體疫苗的篩選與鑒定方法

重組病毒的篩選方法，通常是將β-半乳糖苷酶基因(LacZ)、紅色熒光蛋白(red fluorescent protein，RFP)、綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)等報告基因與轉移載體融合，篩選出純化的重組病毒。但真正理想的重組疫苗不應包含標記基因，因此可利用有痕缺失或無痕缺失的方法去掉報告基因。在多輪蝕斑純化獲得重組病毒后，要進行體外生物學試驗評估其穩(wěn)定性，以期獲得更加安全、有效的疫苗。

4 禽皰疹病毒載體疫苗的研究進展

4.1 以MDV為載體的重組病毒活疫苗

馬立克氏病(MD)是由MDV引起的一種雞的惡性T淋巴細胞瘤疾病，利用致弱株及天然不致病株可以有效地預防本病[27]。 MDV疫苗病毒有3種血清型：致弱的MDVⅠ型，天然不致病的MDVⅡ型及血清Ⅲ型火雞皰疹病毒(HVT)[28]。在3種血清型的疫苗株中，血清Ⅰ型已被用來構建重組病毒以預防禽馬立克氏病[29]。MDV病毒疫苗目前被認為是用于表達多價重組活疫苗最有效的載體，可以表達其他病毒的抗原來誘導保護性免疫原性，這是因為該疫苗即使在卵內(nèi)存在母源抗體的情況下也能抵抗致病性MDV毒株。其中HVT是最近發(fā)展起來的病毒載體，在全世界已經(jīng)被用作家禽業(yè)對抗馬立克氏病的安全有效疫苗。 HVT的優(yōu)點是對雞及其它動物均無致病性，使用安全，疫苗接種后受母源抗體水平干擾小，可在雞體內(nèi)形成長達數(shù)周的病毒血癥，且終生潛伏感染。Iqbal[15]以火雞皰疹病毒為載體利用BAC構建表達H7N1病毒HA基因的重組病毒，Tang等[30]用HVT為載體構建了表達IBDV病毒VP2基因的重組病毒。相似地，它們都選擇UL45/UL46作為插入位點，經(jīng)檢測，病毒生長曲線與親本株相比基本上沒有差異。Zhang等[31]比較重組病毒載體rMDV不同位點的轉錄活性，將H9N2禽流感病毒血凝素基因插入MDV的4個不同區(qū)域，插入?yún)^(qū)域包括MDV基因組中3個自身位點(US2、US10和Meq基因之一)和BAC載體中的外源位點(gpt基因)，研究發(fā)現(xiàn)US2區(qū)域中的HA表達盒顯示出最高的活性，Meq與US10的表達活性相似，表達盒在外源區(qū)gpt基因中具有最低的活性。Andoh等[14]將IBDV的VP2基因分別插入到HVT基因組中UL3-4、UL22-23、UL45-46和US10-SORF3四個位點。研究發(fā)現(xiàn)4株重組病毒在體外表現(xiàn)出的生長活性由高到低依次為rHVT/IBD(US10)>rHVT/IBD(UL22/23)>rHVT/IBD(UL3/4)>rHVT/IBD(UL45/46)。在進行體內(nèi)試驗時，針對IBDV的中和抗體水平rHVT/IBD(UL3/4)株最高。綜合體內(nèi)與體外試驗，rHVT/IBD(UL3/4)最適合作為候選疫苗。這與前面所述[15,30]插入位點為UL45-46的兩株重組病毒相比，并沒有產(chǎn)生相似的體外生長曲線，可能因為選用的啟動子為雞 β-actin 啟動子，而前所述選用的是pec 啟動子。Li等[32]構建針對IBDV的VP2基因的重組病毒，使用Pec啟動子比使用CMV啟動子的rMDV-VP2重組病毒在雞中表現(xiàn)出更高的VP2表達和更強的抗IBDV的抗體應答。除此之外，Ma等[33]對比5種啟動子在MDV重組病毒中的轉錄活性發(fā)現(xiàn)，外源啟動子CMV的重組病毒具有更高的轉錄活性；但在體內(nèi)試驗中，具有最低轉錄活性啟動子ppp38重組病毒針對H9N2攻擊提供50%保護，內(nèi)源啟動子gB重組病毒誘導針對H9N2攻擊提供25%保護，而對外源啟動子CMV和SV40、1.8 kb內(nèi)源啟動子均未提供保護。Cui等[34]比較rMDV-HA和rHVT-HA針對H5N1的高致病性禽流感(HPAIV)和致死性MDV-1菌株814的保護性免疫力研究，表明用rMDV-HA接種雞可誘導產(chǎn)生80%的HPAIV保護，優(yōu)于rHVT-HA的保護率(66.7%)。在動物攻毒試驗中，用rMDV-HA免疫的雞可被完全保護免受強毒性MDV株J-1攻擊，而rHVT-HA僅誘導80%的保護。目前，已經(jīng)有一種針對IBDV的HVT-VP2商品化重組疫苗在某些養(yǎng)雞場使用[35]，其具有完整的保護效力和針對IBDV的終生免疫。家禽痘病毒中，攜帶ILTV包膜糖蛋白gB與UL34基因的重組疫苗、HVT載體攜帶ILTV包膜糖蛋白gI與gD基因的活疫苗，已經(jīng)可以進行商業(yè)購買[36]，這些疫苗并沒有返毒能力。同種疫苗對不同物種的免疫水平也可能存在差異，Palya等[37]評估重組禽流感病毒rHVT-AI能否在不同品種鴨與鵝的體內(nèi)進行復制，發(fā)現(xiàn)不同水生鳥類物種之間檢測到重組病毒的復制率存在顯著差異。構建兩種血清型的重組馬立克氏病毒效果評價如表1所示。

表1 重組雞馬立克氏病毒載體活疫苗Table 1 Recombinant Marek’s virus vectored live vaccine

4.2 以ILTV病毒為載體的重組病毒活疫苗

ILTV通過多次減毒雞胚源培養(yǎng)(CEO)或組織培養(yǎng)(TCO)弱毒疫苗來預防，但這類疫苗具有殘存毒力，使雞產(chǎn)生潛伏性感染。目前把ILTV的糖蛋白VP2基因插入雞痘病毒、火雞皰疹病毒和新城疫病毒的研究較多。Pavlova等[16]構建了缺失UL50基因的傳染性喉氣管炎病毒，并大量表達H5N1型高致病性禽流感病(HPAIV)的血凝素(HA)基因的重組病毒ILTV-△UL50IH5V，在6周齡的雞中評估了這種載體疫苗針對不同H5HPAIV的保護效果。結果顯示，單次滴眼免疫后，所有動物均產(chǎn)生HA特異性抗體。H5N1病毒攻擊后未觀察到臨床癥狀，只有20%的H5N2攻擊動物出現(xiàn)最小的臨床癥狀。

4.3 以鴨腸炎病毒為載體的重組病毒活疫苗

比較常用的鴨腸炎病毒弱毒疫苗株以DEV C-KCE和Vac為主(表2)，在對禽流感病毒的研究中，使用MAGIC技術，將血凝素H5N1病毒基因插入DEV的C-KCE基因組中的gB和UL26[20]，用于產(chǎn)生疫苗株pBAC-C-KCE-HA，這種疫苗提供了針對H5N1 AIV和DEV的快速免疫保護。Liu等[18]利用Fosmid多片段拯救系統(tǒng)構建了兩組重組病毒rDEV-UL41HA和rDEV-US78HA，研究表明這兩組疫苗能提供針對DEV和H5N1 AIV的保護，單劑量106PFU的rDEV-US78HA可以完全保護致死性H5N1的攻擊，rDEV-US78HA比rDEV-UL41HA效果更好。該團隊又利用rDEV-RE6(rDEV-US78HA)重新對SPF雞進行評估，結果顯示rDEV-RE6提供免疫原性，并對致命性H5N1 AIV提供良好保護。在坦布蘇病毒(DTMUV)多價苗研究中，Zou等[17]首次利用CRISPR/Cas9介導的基因編輯策略生成了DEV的 C-KCE-HA/PrM-E三價疫苗，用C-KCE-HA/PrM-E免疫的鴨子增強了針對H5N1和DTMUV體液和細胞的免疫反應。重要的是，單劑量的C-KCE-HA/PrM-E賦予了針對AIV H5N1、DTMUV和DEV的保護。此外，該團隊還利用BAC和MAGIC技術構建了重組病毒C-KCE-E，證明了坦布蘇病毒E蛋白在C-KCE-E感染的雞胚成纖維細胞(CEF)中強烈表達，誘導免疫鴨產(chǎn)生針對DTMUV的中和抗體。Chen等[38]利用Fosmid多片段拯救系統(tǒng)構建了兩組重組病毒rDEV-TE(鴨坦布蘇病毒包膜糖蛋白TE截短形式)和rDEV-PrM/TE(表達TE和前膜蛋白)。動物試驗研究證明,兩種重組病毒在鴨中誘導可測到的坦布蘇病毒中和抗體。兩次免疫后，rDEV-PrM/TE完全保護了鴨子針對坦布蘇病毒的攻毒保護，而rDEV-TE僅授予部分保護。除此之外，DEV也用于生產(chǎn)rDEV-N、rDEV-S和rDEV-S1表達傳染性支氣管炎病毒(IBV)的N、S和/或S1蛋白的重組疫苗[24]。接種rDEV-N和rDEV-S1共價疫苗比使用任何單一rDEV更有效，結果顯示CD4+/ CD8+淋巴細胞比率降低、病毒脫落降低和雞死亡率降低。鴨肝炎病毒1型(DHAV-1)和3型(DHAV-3)在鴨養(yǎng)殖業(yè)中造成重大經(jīng)濟損失，但是目前還沒有同時控制兩種病原體的商業(yè)疫苗。Zou等[25]構建鴨腸炎病毒重組疫苗rC-KCE-2VP1，含有來自鴨肝炎病毒1型和3型的VP1，在兩種不同類型的VP1之間插入一個口蹄疫病毒FMDV的自切割2A元件。動物試驗結果證明，在注入單劑量rC-KCE-2VP1疫苗后，能使鴨產(chǎn)生有效的體液和細胞免疫反應，并完全預防致病性DHAV-1和DHAV-3菌株的挑戰(zhàn)。

5 展望

目前，我國畜禽養(yǎng)殖業(yè)使用傳統(tǒng)禽用疫苗比重最高，因傳統(tǒng)疫苗個體小、養(yǎng)殖周期短、病毒種類和血清型多、變異快，新研制出的疫苗滯后于病毒變異血清型的出現(xiàn)。因此，構建突發(fā)性重大疾病應急反應生物制劑研究平臺，并制備相應制品，需要前瞻性布局[41]。病毒活載體疫苗目前處于研究階段，未來禽病毒疫苗的發(fā)展趨勢仍以篩選安全的病毒載體為基礎，實現(xiàn)針對外源基因的靶向性，同時降低疫苗的生產(chǎn)成本。因此，構建穩(wěn)定的病毒活載體疫苗體系是研發(fā)活載體疫苗的重中之重。隨著水禽養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)?；l(fā)展，新型活載體疫苗技術需要與生產(chǎn)相結合，從而為防控突發(fā)性疾病提供有效的生物制劑。細菌人工染色體技術、fosmid基因文庫和CRISPR/Cas9等基因編輯技術為制備高效多價疫苗提供高效的技術平臺。同時，不同種類的新型疫苗可以通過技術手段進行交叉免疫組合使用，能生產(chǎn)出更高效、快速的多價活載體疫苗。

表2 重組鴨腸炎病毒載體活疫苗Table 2 Recombinant duck enteritis virus vectored live vaccine