顏琿璘 ，黃和 *，高平，陳日檬，曾丹丹，周凱

1. 廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院（湛江 524088）；2. 廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（湛江 524088）；3. 廣東普通高等學(xué)校水產(chǎn)品深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（湛江 524088）；4. 湛江市食品藥品檢驗(yàn)所（湛江 524022）

隨著生活物質(zhì)水平的提高，人們對(duì)鮮活水產(chǎn)品的需求越來越多，為了降低水產(chǎn)品在運(yùn)輸過程中的損耗，漁用麻醉劑的使用開始廣泛，但麻醉劑的殘留量及其安全性問題也備受關(guān)注[1]。目前常使用的麻醉劑有CO2、MS-222、丁香酚類化合物等[2]。

丙泊酚化學(xué)名為2, 6-雙異丙基苯酚[3]，該品為高脂溶性的烷基酚類的短效靜脈麻醉劑，它具有麻醉誘導(dǎo)起效快、蘇醒迅速且功能恢復(fù)完善等優(yōu)點(diǎn)[4]，常見于醫(yī)學(xué)臨床使用。有研究表明，丙泊酚易引起心臟和呼吸抑制[5]。丙泊酚具有效迅速、鎮(zhèn)靜作用強(qiáng)的特點(diǎn)，其引起濫用、意外過量和自殺等案件逐年增多，特別是美國著名歌星邁克爾·杰克遜之死案件[6]，更使丙泊酚受到極大關(guān)注。

目前，關(guān)于樣品中丙泊酚的分析方法有高效液相法[7]、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[8]、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[9]等。丙泊酚麻醉劑的殘留量檢測(cè)分析主要在血液、藥品等范圍，有關(guān)水產(chǎn)品中丙泊酚麻醉劑殘留量的檢測(cè)方法未見報(bào)道。試驗(yàn)采用分散固相萃取的樣品前處理方法，對(duì)水產(chǎn)品中的丙泊酚麻醉劑殘留量的測(cè)定方法進(jìn)行研究，旨在建立一種能夠測(cè)定水產(chǎn)品中丙泊酚麻醉劑的簡單、快速、靈敏的方法，為我國水產(chǎn)品中丙泊酚麻醉劑殘留檢測(cè)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南美白對(duì)蝦、鱖、金鯧，洗凈，去鱗、去皮，取出肌肉部分，用攪拌機(jī)攪碎，放入-18 ℃冰箱中保存，備用。

丙泊酚（CAS號(hào)2078-54-8，濃度≥99%）、內(nèi)標(biāo)物百里香酚（CAS號(hào)89-83-8，濃度≥99%）、無水硫酸鎂（上海麥克林公司）；乙腈、甲醇、乙酸乙酯（色譜純，Thermo Fisher公司）；無水硫酸鎂（國藥集團(tuán)公司）；QuEchERs dSPE EMR-Lipid、EMR-polish（安捷倫公司）；ProElut PLS（150 mg/6 mL，迪馬科技）；C18反相固相萃取柱（500 mg/3 mL，Thermos公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

GC-2010 PLUS氣相色譜儀（日本島津公司）；ST-16R型高速冷凍離心機(jī)（Thermos公司）；TP-220 A型電子天平（湘儀天平儀器有限公司）；VTX-3000 L型旋渦混勻器（東京理化有限公司）；KQ-250 DE型超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；超純水機(jī)（Thermos公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

稱取2.0 g（精確至0.01 g）1.1所述樣品于50 mL離心管中，加入一粒均質(zhì)子，加入10 mL乙酸乙酯，漩渦振蕩1 min，離心機(jī)以5 000 r/min離心5 min，取出上清液于15 mL具塞離心管中，待凈化。

1.3.2 凈化

取EMR-Liplid dSPE分散凈化管，加入5 mL水，搖勻，然后吸取5 mL上述待凈化液至凈化管中，漩渦振蕩1 min，離心機(jī)以5 000 r/min離心3 min，將離心后的提取液移取5 mL至EMR Lipid Polish反萃取管中，漩渦混合，吸取1 mL凈化液于進(jìn)樣小瓶中，待GC分析。

1.4 色譜條件

色譜柱：HP-50+（30.0 m×0.25 mm×0.25 μm）。升溫程序：色譜柱初溫80 ℃，保持3 min，然后以15 ℃/min升溫至260 ℃，保持10 min。進(jìn)樣口溫度：230 ℃。進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣。進(jìn)樣體積：1 μL。載氣：高純氮?dú)猓兌取?9.999%）。流速：1.0 mL·min-1。模式：恒壓。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取適量的丙泊酚標(biāo)準(zhǔn)品于棕色容量瓶中，用乙酸乙酯溶解并定容至刻度，配成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，在-18 ℃條件下避光保存，有效期6個(gè)月。使用時(shí)用乙酸乙酯將儲(chǔ)備液稀釋成試驗(yàn)所需濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，臨用現(xiàn)配。

2 結(jié)果與討論

2.1 溶劑的選擇

試驗(yàn)采用氣相色譜法測(cè)定丙泊酚麻醉劑殘留量。使用的溶劑主要有乙酸乙酯-丙酮（1∶1，V/V）[10]、乙酸乙酯[11]和丙酮[7]三種。將丙泊酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，分別用乙酸乙酯-丙酮（1∶1，V/V）、乙酸乙酯和丙酮稀釋成10 μg/mL，進(jìn)行氣相色譜檢測(cè)，色譜圖如圖1所示。結(jié)果顯示，當(dāng)乙酸乙酯-丙酮（1∶1，V/V）作為溶劑時(shí)，基線不平穩(wěn)，有較大干擾峰出現(xiàn)；當(dāng)乙酸乙酯作為溶劑時(shí)，無雜峰干擾，且基線平穩(wěn)；當(dāng)丙酮作為溶劑時(shí)，目標(biāo)峰與內(nèi)標(biāo)峰附近基線不平穩(wěn)，影響準(zhǔn)確定量。所以，選擇乙酸乙酯為最終溶劑。

2.2 色譜條件優(yōu)化

2.2.1 柱溫的選擇

試驗(yàn)采用HP-50+毛細(xì)管柱，該類柱子的使用溫度范圍是40～280 ℃，因此柱溫選擇在正常使用范圍內(nèi)，按照溫度梯度變化，選擇70，80和90 ℃依次分析，色譜圖見圖2。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，柱溫的變化除了對(duì)保留時(shí)間有影響外，其對(duì)峰型不會(huì)有較大的影響，當(dāng)柱溫降低時(shí)，出現(xiàn)基線不平穩(wěn)現(xiàn)象；當(dāng)柱溫升高時(shí)，峰形有拖尾現(xiàn)象。因此，為了考慮峰形，選擇80 ℃作為試驗(yàn)柱溫。

圖1 三種不同溶劑比較色譜圖

圖2 不同柱溫比較色譜圖

2.2.2 進(jìn)樣口溫度的設(shè)置

試驗(yàn)對(duì)進(jìn)樣口溫度的考察結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表示進(jìn)樣口溫度對(duì)峰形沒有太大的影響。從不同進(jìn)樣口溫度下相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時(shí)間對(duì)比可知，不同進(jìn)樣口溫度對(duì)保留時(shí)間也沒有太大影響，考慮到儀器使用壽命，選擇較低溫度作為試驗(yàn)溫度，因此選擇230 ℃為進(jìn)樣口溫度。

2.3 凈化條件的選擇

由于蝦肉、魚肉等水產(chǎn)品中含有大量的蛋白質(zhì)、脂肪等物質(zhì)，其基質(zhì)特別復(fù)雜[12]，對(duì)于丙泊酚的凈化方法報(bào)道較少，所以試驗(yàn)采用不同固相萃取方式進(jìn)行樣品凈化。

2.3.1 ProElut PLS固相萃取柱凈化

黃武等[13]采用ProElut PLS固相萃取柱凈化，高效液相色譜法測(cè)定丁香酚類化合物。因此，在此試驗(yàn)基礎(chǔ)上，嘗試使用ProElut PLS的方法進(jìn)行凈化，其操作步驟是：樣品經(jīng)丙酮提取后，將上清液移至10 mL的試管中，用3 mL甲醇、水活化ProElut PLS固相萃取柱，加入3 mL試樣，然后用5%的甲醇水淋洗，抽干，3 mL甲醇洗脫，洗脫液用氮吹儀吹至盡干，用乙酸乙酯復(fù)溶至1 mL，過濾膜，待氣相測(cè)定。結(jié)果表明，通過PLS凈化過的樣品在目標(biāo)峰出現(xiàn)的時(shí)候，無明顯雜質(zhì)影響，因此對(duì)其進(jìn)行了加標(biāo)試驗(yàn)，其色譜圖見圖4。結(jié)果顯示，雖然在空白樣品凈化時(shí)，雜峰對(duì)樣品的出峰沒有明顯干擾，但是在加標(biāo)回收試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)其在目標(biāo)物和內(nèi)標(biāo)物出峰時(shí)間未出峰，時(shí)間略有延遲，檢測(cè)到的峰不是目標(biāo)峰所在保留時(shí)間，因此此方法不適用。

圖3 不同進(jìn)樣口溫度比較色譜圖

圖4 ProElut PLS柱加標(biāo)色譜圖

2.3.2 C18反相固相萃取柱凈化

C18反相固相萃取柱是以強(qiáng)疏水性硅膠基體為吸附劑，對(duì)非極性化合物具有較好的保留性，目前較為廣泛應(yīng)用[14]。試驗(yàn)嘗試使用C18反相固相萃取柱的方法進(jìn)行凈化，其操作步驟是：樣品經(jīng)丙酮提取后，將上清液移至10 mL的試管中，加入200 μL四甲基氫氧化銨，吹至盡干，然后用乙酸乙酯復(fù)溶至5 mL。將C18柱置于固相萃取裝置，用5 mL甲醇、水活化，加入5 mL試樣，然后用5%的甲醇水淋洗，抽干，5 mL甲醇洗脫，洗脫液用氮吹儀吹至盡干，用乙酸乙酯復(fù)溶至1 mL，過濾膜，待氣相測(cè)定。結(jié)果表明，在目標(biāo)峰出現(xiàn)的時(shí)候，無明顯雜質(zhì)影響，因此對(duì)其進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)，其色譜圖見圖5。結(jié)果顯示，雖然在空白樣品中，雜質(zhì)峰的影響很小，但是在進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)后，并未出現(xiàn)目標(biāo)峰，回收率低，無法滿足檢測(cè)條件，因此C18反相固相萃取柱方法不可取。

圖5 C18凈化加標(biāo)色譜圖

2.3.3 EMR-Lipid結(jié)合EMR-Polish反萃取管凈化

EMR-Lipid增強(qiáng)型脂質(zhì)去除產(chǎn)品和EMR-Lipid Polish反萃管具有出色的基質(zhì)凈化效果，能夠去除大部分基質(zhì)（尤其是脂質(zhì)），且不會(huì)對(duì)分析物回收率造成顯著影響[15]。其操作步驟是：樣品經(jīng)10 mL丙酮提取后，上清液待凈化。取15 mL EMR-Liplid dSPE分散凈化管，加入5 mL水，搖勻，然后吸取5 mL待凈化液至凈化管中，旋渦振蕩1 min，充分混勻，離心機(jī)以5 000 r/min離心3 min，將離心后的提取液移取至EMR Lipid Polish反萃取管中，旋渦混合，吸取1 mL凈化液于進(jìn)樣小瓶中，待氣相分析。結(jié)果表明，EMR-Lipid結(jié)合EMR-Polish反萃取管凈化的空白樣品在目標(biāo)峰出現(xiàn)時(shí)未有雜峰影響，因此對(duì)其進(jìn)行了加標(biāo)試驗(yàn)，其色譜圖見6。結(jié)果顯示，經(jīng)過凈化的樣品目標(biāo)峰、內(nèi)標(biāo)峰完全與雜峰分離，對(duì)其進(jìn)行的加標(biāo)回收試驗(yàn)回收率較高，經(jīng)過多次加標(biāo)發(fā)現(xiàn)其重現(xiàn)性較好。因此，試驗(yàn)選擇了這種凈化方式。

圖6 EMR-Lipid結(jié)合EMR-Polish反萃取管加標(biāo)凈化加標(biāo)色譜圖

2.4 加標(biāo)回收率

在南美白對(duì)蝦、鱖、金鯧中分別添加質(zhì)量濃度為1.0，2.0和10.0 μg/mL水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度為40.0 μg/mL，同時(shí)設(shè)置一個(gè)空白，計(jì)算丙泊酚麻醉劑的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見表1。結(jié)果表明，當(dāng)丙泊酚添加質(zhì)量濃度為1.0～10.0 μg/mL時(shí)，其加標(biāo)回收率為83.75%～102.18%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.54%～7.39%，表明該方法的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性好，符合殘留分析要求。

表1 丙泊酚加標(biāo)回收率

2.5 方法的線性范圍

根據(jù)1.4色譜條件，將1.0 mg/mL的丙泊酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用乙酸乙酯稀釋成0.4，0.8，1.0，2.0，4.0，8.0和10.0 μg/mL的丙泊酚標(biāo)準(zhǔn)工作液，然后將1.0 mg/mL的百里香酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用乙酸乙酯稀釋成4.0 μg/mL的百里香酚內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行分析，以丙泊酚和百里香酚的濃度比為橫坐標(biāo)，峰面積比為縱坐標(biāo)，做回歸方程。結(jié)果表明，以該方法分析，丙泊酚在10.0～100.0 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)其線性關(guān)系良好，線性回歸方程為Y=1.198 2X-0.050 4，R2=0.999，檢出限為0.3 mg/kg。

2.6 方法的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性

取同一濃度的丙泊酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，共5份，分別連續(xù)進(jìn)樣后，根據(jù)峰面積測(cè)定，RSD值為1.3%，小于5%，表明該方法的重現(xiàn)性良好；同時(shí)將標(biāo)準(zhǔn)溶液置于0，3，9，12和24 h，測(cè)定其含量，RSD值為2.5%，表明該方法的穩(wěn)定性良好。

3 結(jié)論

通過前處理方法的優(yōu)化，樣品用乙酸乙酯提取后，使用EMR-Lipid結(jié)合EMR-Polish反萃取管凈化，經(jīng)過0.25 μm的濾膜過濾后，用氣相色譜儀檢測(cè)。通過優(yōu)化色譜條件，確定色譜條件為HP-50+毛細(xì)管柱，F(xiàn)ID檢測(cè)器，色譜柱溫度80 ℃、進(jìn)樣口溫度230 ℃、檢測(cè)器溫度280 ℃，升溫程序：色譜柱初溫80 ℃，保持3 min，然后以15 ℃/min，至260 ℃，保持10 min。進(jìn)樣模式為不分流，進(jìn)樣量1 μL，流速1 mL/min。水產(chǎn)品中丙泊酚質(zhì)量濃度在0.4～10.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，樣品在加標(biāo)質(zhì)量濃度為0.4～10.0 μg/mL范圍內(nèi)，其平均加標(biāo)回收率為83.75%～102.18%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.54%～7.39%，檢出限為0.3 mg/kg。試驗(yàn)所建立的檢測(cè)方法適用于水產(chǎn)品中丙泊酚殘留的測(cè)定。