楊勤，況剛，周濃，陽(yáng)文武

1. 重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校（重慶 404120）；2. 重慶第二師范學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院（重慶 400067）；3. 重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院（重慶 404000）；4. 重慶市萬(wàn)州食品藥品檢驗(yàn)所（重慶 404000）

T-2毒素屬于單端孢霉烯族化合物，是鐮孢菌屬中的三線鐮刀菌、擬枝孢鐮刀菌和梨孢鐮刀菌的代謝產(chǎn)物，主要污染玉米、大麥、大米、小麥等[1]。T-2毒素的毒性大，主要危害消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)，具有致畸性和致癌性[2-3]。T-2毒素經(jīng)口、皮膚、注射等接觸方式可引起造血、淋巴、胃腸組織及皮膚的損害。此外，有些地區(qū)的食管癌和大骨節(jié)病的高發(fā)病率與T-2毒素有關(guān)[4]。T-2毒素在室溫條件下相當(dāng)穩(wěn)定，放置6～7年或加熱至100～120 ℃ 1 h毒性不減，但用堿處理后水解成相應(yīng)的醇，毒性降低[5]。對(duì)人體來(lái)說(shuō)，T-2毒素的平均慢性膳食暴露數(shù)值最高的人群為學(xué)步兒童與嬰兒，最大上限值分別為64.8和62.9 ng/（kg·bw·d）[6]。此外，以色列、俄羅斯、挪威等國(guó)均規(guī)定了谷物等食品中T-2毒素的限量（100 μg/kg），而我國(guó)GB 2761—2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》中目前暫無(wú)相關(guān)要求。鑒于生濕面制品在日常生活中的重要性，對(duì)生濕面制品中T-2毒素的含量水平進(jìn)行監(jiān)測(cè)對(duì)確保生濕面制品安全具有十分重要的意義。

目前，T-2毒素的分析檢測(cè)方法研究主要集中在飼料、谷物、燕麥等[7-10]農(nóng)產(chǎn)品中的檢測(cè)。關(guān)于生濕面制品中T-2毒素的檢測(cè)鮮有報(bào)道。T-2毒素的主要檢測(cè)方法有HPLC-FLD法[11-12]、氣相色譜（Gas chromatography，GC）法[13]、酶聯(lián)免疫吸附（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA）法[14]及高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（High performance liquid chromatographytandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）法等[15-16]。試驗(yàn)采用操作簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性好的HPLC-FLD法測(cè)定生濕面制品中T-2毒素的含量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

加堿濕面6批次、未加堿濕面6批次、餃子皮5批次、餛飩皮2批次、棒棒面1批次、刀削濕面1批次、手拉濕面1批次，樣品購(gòu)自重慶市東北片區(qū)（萬(wàn)州區(qū)、梁平區(qū)、忠縣、開州區(qū)、云陽(yáng)縣、奉節(jié)縣、巫山縣、巫溪縣、城口縣等9個(gè)區(qū)縣）不同攤位，具體見表5。

乙腈、甲醇、甲苯（色譜純，北京迪馬科技有限公司）；T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg/mL，北京曼哈格生物科技有限公司）；1-氰酸蒽對(duì)照品（北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院）；T-2毒素免疫層析親和柱（青島普瑞邦生物工程有限公司）；其它試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilengt 1260高效液相色譜儀（配備熒光檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫科技有限公司）；摩爾基因型1850C超純水機(jī)（上海摩勒科學(xué)儀器有限公司）；IKA MS3渦旋振蕩器（德國(guó)IKA公司）；Waters固相萃取裝置（美國(guó)Waters公司）；Sartorius SQP分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；BiotageTurboVap2氮吹儀（瑞典Biotage公司）：XMTD-4000電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 試劑配制

提取液：甲醇-水（8∶2，V/V）。

4-二甲基氨基吡啶溶液：準(zhǔn)確稱取12.35 mg 4-二甲基氨基吡啶于容量瓶中，精密加入38 mL甲苯溶解，即得。

1-氰酸蒽溶液：準(zhǔn)確稱取5.37 mg 1-氰酸蒽于容量瓶中，精密加入17.9 mL甲苯溶解，即得。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)中間液配制：準(zhǔn)確移取0.5 mL T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液（質(zhì)量濃度為100 μg/mL）于50 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容，得質(zhì)量濃度為1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液，于4 ℃保存，有效期為3個(gè)月。

T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)工作液配制：分別準(zhǔn)確移取0.1，0.2，0.5，1.0和2.0 mL T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)中間液于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容，配制成質(zhì)量濃度分別為10，20，50，100和200 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)工作液的衍生：取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液各1.0 mL，在50 ℃下用氮?dú)獯蹈?，加?0 μL 4-二甲基氨基吡啶溶液和50 μL 1-氰酸蒽溶液，在渦旋混合器上混勻1 min，于50 ℃反應(yīng)15 min，在冰水中冷卻10 min后取出，在50 ℃下氮?dú)獯蹈?，?.0 mL流動(dòng)相溶解，待HPLC-FLD測(cè)定。

1.3.3 樣品溶液制備

提取：稱取10 g（精確到0.001 g）混合均勻的樣品于離心管中，加入適量提取液，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用提取液定容至刻度，混勻，渦旋振蕩提取10 min，定量濾紙過(guò)濾。移取25.0 mL濾液加入25.0 mL水稀釋混勻，經(jīng)玻璃纖維濾紙過(guò)濾至濾液澄清，濾液備用。

凈化和洗脫：將免疫親和柱連接于玻璃注射器下，準(zhǔn)確移取10.0 mL提取濾液，注入玻璃注射器中。調(diào)節(jié)壓力使溶液以約1 d/s的流速緩慢通過(guò)免疫親和柱，直至空氣進(jìn)入親和柱中。用10 mL水淋洗親和柱，流速為2 d/s，直至空氣進(jìn)入親和柱中，棄去全部流出液，抽干小柱。準(zhǔn)確加入1.0 mL甲醇洗脫，流速約為1 d/s，收集洗脫液。

衍生：洗脫液在50 ℃下用氮?dú)獯蹈?，按?biāo)準(zhǔn)工作液的衍生步驟進(jìn)行。

1.3.4 儀器條件

流動(dòng)相：乙腈-水，對(duì)流動(dòng)性比例進(jìn)行優(yōu)化。柱溫：35 ℃。流速：1.0 mL/min。進(jìn)樣量：20 μL。檢測(cè)波長(zhǎng)：激發(fā)波長(zhǎng)381 nm，發(fā)射波長(zhǎng)470 nm。對(duì)色譜柱進(jìn)行考察。

1.3.5 方法的線性范圍、檢出限及定量限測(cè)定

按照優(yōu)化的色譜條件，對(duì)衍生的標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行測(cè)定，以待測(cè)T-2毒素的峰面積（y）為縱坐標(biāo)，T-2毒素的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在空白基質(zhì)中依次加入較低質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后進(jìn)行測(cè)定，以3倍信噪比（RS/N=3）和10倍信噪比（RS/N=10）確定方法的檢出限和定量限。

1.3.6 方法的精密度

精密吸取20 μL“1.3.2”項(xiàng)下衍生后的標(biāo)準(zhǔn)溶液，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，按照優(yōu)化的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算RSD。

1.3.7 方法的穩(wěn)定性

精密吸取同一份空白加標(biāo)供試品溶液（加標(biāo)量30.0 μg/kg），按照優(yōu)化的色譜條件，分別于0，2，4，6，8，10和12 h進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算RSD。

1.3.8 方法的回收率和重復(fù)性

稱取10 g（精確到0.001 g）空白試樣，分別進(jìn)行10.0，30.0和100.0 μg/kg 3個(gè)加標(biāo)水平的基質(zhì)加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)加標(biāo)水平稱取6份樣品，按“1.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并進(jìn)行HPLC-FLD分析，計(jì)算測(cè)得總量、平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative standard deviation，RSD）。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱的考察

色譜柱的選擇對(duì)T-2毒素的分離效果影響很大?？疾毂?中四種色譜柱對(duì)T-2毒素分離效果的影響。結(jié)果表明，Agilent ZORBAX SB色譜柱對(duì)T-2毒素的分離效果最好（圖1D），Diamonsil、Agilent 5 TC和Inertsil ODS-SP3種類型色譜柱沒能將T-2毒素分離好（圖1A，B和C）。

表1 色譜柱型號(hào)

圖1 不同色譜柱下標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

2.2 色譜條件的優(yōu)化

流動(dòng)相的不同配比直接影響T-2毒素的出峰時(shí)間及分離效果。在選用Agilent ZORBAX SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μ m）的色譜柱條件下，考察表2中三組流動(dòng)相對(duì)T-2毒素分離效果的影響。結(jié)果表明，在1組色譜條件下，T-2毒素峰分離效果理想，分離度＞1.5（圖2A），其余兩組色譜條件下T-2毒素峰與雜質(zhì)峰均分離不完全（分離度＜1.5），且在1組色譜條件下空白加標(biāo)樣品也可以實(shí)現(xiàn)較好的分離（圖2B）。

表2 流動(dòng)相配比及分離效果

圖2 不同色譜條件下標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白加標(biāo)樣品色譜圖

2.3 方法的線性范圍、檢出限及定量限

用HPLC-FLD法測(cè)定時(shí)，T-2毒素在10～200 ng/mL質(zhì)量濃度線性范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系，r=0.999 9。當(dāng)生濕面制品的稱樣量為10 g時(shí)，檢測(cè)限為10 μg/kg，定量限為30 μg/kg。結(jié)果見表3。

表3 線性關(guān)系及檢測(cè)限、定量限

2.4 方法的精密度

結(jié)果表明，T-2毒素峰面積的RSD為1.3%，說(shuō)明儀器精密度良好。

2.5 方法的穩(wěn)定性

結(jié)果表明，T-2毒素峰面積的RSD為2.5%，說(shuō)明該供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 方法的回收率和重復(fù)性

HPLC-FLD法中，當(dāng)生濕面制品的稱樣量為10 g時(shí)，T-2毒素在10.0，30.0和100.0 μg/kg 3個(gè)加標(biāo)水平的平均回收率分別為73.4%，83.0%和94.6%，RSD分別為5.6%，4.0%和1.4%，表明該方法準(zhǔn)確度和重復(fù)性均滿足分析要求。結(jié)果見表4。

表4 方法回收率和RSD（n=6）

2.7 樣品測(cè)定

取22批生濕面制品，按“1.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在優(yōu)化所得色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，22份樣品中有5批次檢出T-2毒素，但均低于檢出限。檢出T-2毒素的樣品中，有4批次是沒有加堿的樣品，另外一批樣品不確定是否加堿。結(jié)果見表5。

表5 樣品T-2毒素含量測(cè)定結(jié)果 μ g/kg

3 結(jié)論與討論

GB 5009.118—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中T-2毒素的測(cè)定》中的色譜條件，只規(guī)定了色譜柱的長(zhǎng)度，沒有規(guī)定色譜柱的品牌、型號(hào)，試驗(yàn)通過(guò)不斷摸索，最終選取Agilent ZORBAX SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）的色譜柱。在此色譜柱條件下，T-2毒素峰形良好、分離效果好。此外，試驗(yàn)還對(duì)T-2毒素色譜峰的出峰時(shí)間進(jìn)行了調(diào)整，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)乙腈-水為78∶22（V/V）時(shí)，樣品分離效果理想（分離度＞1.5），可用于生濕面制品中T-2毒素的檢測(cè)。當(dāng)生濕面制品的稱樣量為10 g時(shí)，檢測(cè)限為10 μg/kg，定量限為30 μg/kg。該方法精密度、重復(fù)性良好，且空白加標(biāo)供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。生濕面制品中的T-2毒素在10.0，30.0和100.0 μg/kg 3個(gè)加標(biāo)水平的平均回收率分別為73.4%，83.0%和94.6%，RSD分別為5.6%，4.0%和1.4%。通過(guò)優(yōu)化樣品前處理過(guò)程和色譜條件，試驗(yàn)建立了生濕面制品中T-2毒素含量的免疫親和柱-高效液相色譜熒光法的測(cè)定方法，該方法操作步驟簡(jiǎn)便、快速靈敏、重現(xiàn)性好，適用于大批量生濕面制品中 T-2毒素的快速檢測(cè)。

T-2毒素性質(zhì)穩(wěn)定，不易分解，容易在人體內(nèi)積蓄，長(zhǎng)期食用含有T-2毒素的生濕面制品，很有可能引起身體不適，甚至?xí)谢及┌Y的風(fēng)險(xiǎn)。生濕面制品是深受廣大人民群眾喜愛的食品，男女老少皆宜，每年的消耗量巨大，而《國(guó)家食品安全監(jiān)督抽檢實(shí)施細(xì)則 2019年版》中生濕面制品的檢驗(yàn)項(xiàng)目未包含T-2毒素，為提高生濕面制品的質(zhì)量，保證人民飲食安全，應(yīng)盡快制定相應(yīng)細(xì)則，加強(qiáng)對(duì)生濕面制品中T-2毒素的監(jiān)控。

樣品測(cè)定中發(fā)現(xiàn)：加堿濕面中均未檢出T-2毒素，這是否與加堿后T-2毒素在堿性條件下分解有關(guān)，需要更進(jìn)一步的研究。