柳毅，尹斯雅

保定市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所（保定 071051）

中國的養(yǎng)驢歷史有4 000余年[1]。驢肉具有細嫩、美味、營養(yǎng)價值高的特點，并具有很高的保健功能[2]，素有“天上龍肉，地下驢肉”之說[3]。2018年，被冠以“中國驢肉火燒之鄉(xiāng)”的河北河間，一些家庭作坊和正規(guī)企業(yè)使用價格便宜的馬肉、騾子肉及豬肉冒充價格昂貴的驢肉[4-5]。這些“假驢肉”被批量發(fā)往北京、山東等地的驢肉火燒店[4]，給驢肉的消費市場帶來負面影響。

檢測動物源性成分的方法包括傳統(tǒng)方法、免疫學方法、分子生物學方法。分子生物學方法是最為成熟的檢測方法，如環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）技術(shù)，它是2000年由日本Notomi等[6]研發(fā)出來的一種新的核酸擴增方法。LAMP反應(yīng)結(jié)果可以直接通過肉眼進行觀察，所用設(shè)備簡單、花費少，又能滿足快速檢測的需要，在肉類摻假成分檢測中已廣泛應(yīng)用[7-11]。

線粒體DNA（mtDNA）屬于高等動物中唯一的核外遺傳物質(zhì)，通常利用線粒體的基因來鑒定肉類成分[12]。檢測驢源性成分的特異性靶基因主要包括：線粒體ATPase 6基因[13]、細胞色素b（Cyt b）基因[14]等。其中，針對線粒體ATPase 6基因的檢測比較廣泛。

試驗旨在開發(fā)一項新的檢測食品中驢源性成分的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)。試驗結(jié)果可為提高驢肉制品的安全性提供一定技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料

18種肉制品，包括驢肉、驢騾肉、馬肉、豬肉、牛肉、山羊肉、綿羊肉、狗肉、鴨肉、鵝肉、狐貍?cè)狻⑼萌?、鴿子肉、雞肉、魚肉、鼠肉、野兔肉、駱駝肉（購自保定出入境檢驗檢疫局、保定各大超市及農(nóng)貿(mào)市場，所有樣品保證質(zhì)量，防止不同肉制品交叉污染）。

1.1.2 儀器與設(shè)備

PCR擴增儀（德國Biometra公司）；Nanodrop 2000分光光度計（美國Thermo scientific公司）；BINDA 2020D凝膠成像儀（北京賓達英創(chuàng)有限公司）；CFX96 Touch實時熒光PCR儀（美國Bio-Rad公司）。

1.1.3 主要試劑

脫氧核糖核苷酸（dNTPs）；10×Buffer、MgSO4、100 bp DNA Ladder Marker、Bst DNA聚合酶（Large fragment）、Alu I限制性內(nèi)切酶（寶生物工程（大連）有限公司）；SYBR Green I熒光染料（Invitrogen，USA）；LAMP引物、實時熒光定量PCR引物、探針（上海生工生物工程有限公司）；組織基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 動物基因組DNA的制備

按照離心柱型基因組DNA提取試劑盒提取動物基因組DNA。

1.2.2 LAMP的引物設(shè)計

選用驢的線粒體ATPase 6基因作為特異性基因。依照Genebank中驢的線粒體ATPase 6基因（GenBank No.X97337.1），使用blast對此序列進行同源性分析，確定其保守序列。通過使用Primer premier 5.0和DNAMAN軟件設(shè)計LAMP的特異性引物，最終在序列10 940至11 137區(qū)域處設(shè)計一套LAMP反應(yīng)的引物（外引物F3和B3，內(nèi)引物FIP和BIP），具體的引物信息見表1。

表1 驢肉的線粒體ATPase 6基因

1.2.3 LAMP反應(yīng)特異性檢測方法建立

按試劑盒提取法提取供試動物基因組DNA作為模板，初步確定25 μL LAMP預(yù)反應(yīng)體系，其成分包括：內(nèi)引物FIP和BIP各0.64 μmol/L，外引物F3和B3各0.16 μmol/L，dNTPs混合液1.0 mmol/L，1×Thermopol緩沖液，MgSO416 mmol/L，Bst DNA聚合酶大片段320 U/mL，模板DNA 50 ng/μL。

LAMP反應(yīng)程序為：將所需試劑依次添加到小離心管中，放入水浴鍋中，設(shè)置反應(yīng)溫度62 ℃，時間60 min；80 ℃，反應(yīng)5 min，終止反應(yīng)。產(chǎn)物進行2.0%瓊脂糖凝膠電泳分析。根據(jù)是否產(chǎn)生梯度條帶判斷LAMP擴增反應(yīng)的發(fā)生情況。

1.2.4 LAMP反應(yīng)條件的優(yōu)化

在引物特異性強的基礎(chǔ)上，優(yōu)化反應(yīng)體系及反應(yīng)條件。分別對Mg2+添加量、dNTPs添加量、內(nèi)外引物濃度比、Bst DNA聚合酶進行體系優(yōu)化，對反應(yīng)溫度進行反應(yīng)條件的優(yōu)化。進行3次平行優(yōu)化試驗，保證試驗條件的穩(wěn)定性。

1.2.5 模擬混合樣品中驢源性成分的檢測限

以純羊肉為原料，按比例摻加驢肉，其中添加的驢肉含量分別為2%，1%，0.5%，0.1%，0.01%和0.001%，對其進行LAMP的檢測分析，驗證引物體系用于模擬混合樣品檢測限。通過產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳法、熒光可視法和沉淀可視法比較3種產(chǎn)物檢測方法的優(yōu)越性。

1.2.6 實際樣品的檢測

利用試驗建立的LAMP方法對市售的85份熟驢肉制品進行實際樣品的檢測，并與行業(yè)標準SN/T 3730.4—2013實時熒光PCR法檢測所得數(shù)據(jù)進行對比。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性檢測結(jié)果

將18種動物樣品按照試劑盒方法提取DNA后，按照1.2.3體系進行LAMP擴增，進行瓊脂糖凝膠電泳，以是否產(chǎn)生梯度條帶判斷引物特異性。結(jié)果如圖1所示，試驗設(shè)計的驢源性引物只對驢肉和驢騾肉進行擴增，且對上述其他16個肉類樣品均無擴增。證明試驗設(shè)計的驢源性引物具有良好特異性。

圖1 凝膠電泳特異性分析

2.2 LAMP反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 Mg2+添加量優(yōu)化結(jié)果

如圖2所示，試驗選擇最適宜的Mg2+添加量4.0 μ L。

圖2 Mg2+添加量的優(yōu)化

2.2.2 dNTPs添加量的優(yōu)化

如圖3所示，試驗選用2.5 μL的dNTPs添加量。

圖3 dNTPs添加量的優(yōu)化

2.2.3 內(nèi)外引物濃度比的優(yōu)化

如圖4所示，試驗選用1∶8引物濃度比。

圖4 內(nèi)外引物濃度比的優(yōu)化

2.2.4 Bst DNA聚合酶緩沖液添加量的優(yōu)化

由圖5可知，當緩沖液添加量為0.5 μL時，擴增條帶不清晰；隨著添加量增加，特異性擴增條帶在2.0 μL時最亮且清晰；繼續(xù)增加，條帶的清晰度變暗。綜合考慮，試驗采用2.0 μL的緩沖液添加量。

圖5 緩沖液濃度的優(yōu)化

2.2.5 反應(yīng)溫度對LAMP反應(yīng)擴增效率的影響

如圖6所示，試驗采用更為穩(wěn)定的62 ℃作為反應(yīng)溫度。

圖6 反應(yīng)溫度的優(yōu)化

2.2.6 優(yōu)化后的LAMP反應(yīng)體系

經(jīng)過對各條件的優(yōu)化試驗，試驗最終確定LAMP檢測食品中驢源性成分的反應(yīng)溫度為62 ℃，反應(yīng)時間60 min，最終25 μL LAMP反應(yīng)體系包括：內(nèi)引物FIP和BIP各0.64 μmol/L，外引物F3和B3各0.08 μmol/L，dNTPs混合液0.125 mmol/L，1×Thermopol緩沖液，MgSO416 mmol/L，Bst DNA聚合酶大片段640 U/mL，模板DNA 2 ng/μL。

2.3 模擬混合樣品中驢源性成分的檢測限

2.3.1 LAMP凝膠電泳法的檢測限

將模擬的混合樣品提取模板后進行LAMP反應(yīng)，結(jié)果如圖7所示。當驢肉含量為2%～0.1%時，均出現(xiàn)陽性擴增；但當驢肉含量為0.01%和0.001%時，沒有出現(xiàn)擴增條帶。因此，LAMP檢測模擬混合樣品中驢源性成分的凝膠電泳檢測限為0.1%。

圖7 凝膠電泳法的檢測限

2.3.2 LAMP熒光可視法檢測限

將模擬的混合樣品提取模板后進行LAMP反應(yīng)，結(jié)果如圖8所示。當驢肉含量為2%～0.01%時，顯示綠色熒光（圖示為無色）；但當驢肉含量為0.001%時，熒光顯示染料原本的橙色（圖示為黑色）不變。因此，LAMP檢測模擬混合樣品中驢源性成分的熒光可視法檢測限為0.01%。

2.3.3 LAMP沉淀可視法檢測限

將模擬的混合樣品提取模板后進行LAMP反應(yīng)，結(jié)果如圖9所示。當驢肉含量為2%～0.1%時，可出現(xiàn)白色沉淀；當驢肉含量為0.01%和0.001%時，產(chǎn)生的微量沉淀不易被肉眼觀察到。因此，LAMP檢測模擬混合樣品中驢源性成分的沉淀可視法檢測限為0.1%。

圖8 熒光可視法檢測限

圖9 沉淀可視法檢測限

2.4 SN/T 3730.4—2013實時熒光PCR和LAMP方法對實際樣品中驢源性成分檢測結(jié)果的比較

利用已建立的LAMP方法和SN/T 3730.4—2013實時熒光PCR的2種方法對實際購買的85份樣品進行檢測。經(jīng)檢測，SN/T 3730.4—2013實時熒光PCR法檢出的驢肉摻假數(shù)為4個，分別來自各小攤販的驢肉火燒和驢肉燜子。LAMP方法檢出的驢肉摻假數(shù)為5個，分別來自各小攤販的驢肉火燒和驢肉燜子。

試驗根據(jù)敏感性（Sensitivity）、特異性（Specificity）及符合率（Coincidence rate）3個指標對LAMP方法進行方法學評價。這3個指標計算公式如式（1）～（3）所示。

根據(jù)檢測結(jié)果，以SN/T 3730.4—2013檢測為標準，則85份樣品中以檢出的驢肉摻假數(shù)表示為真陽性數(shù)，即為4；相反沒有摻假的樣品數(shù)表示為真陰性數(shù)，即為81。LAMP方法檢出的驢肉摻假真陽性數(shù)為4，沒有摻假的真陰性數(shù)為80，假陽性數(shù)為1，假陰性數(shù)為0。

LAMP方法的敏感性=3/（3+0）=100%；LAMP方法的特異性=80/（80+1）=98.77%；LAMP方法的符合率=（4+80）/85=98.82%。

由此可獲得LAMP方法在試驗中的敏感性、特異性和符合率，結(jié)果匯總見表2。

表2 LAMP方法評價

3 結(jié)論

特異性引物設(shè)計是LAMP檢測方法建立的關(guān)鍵。比較篩選出檢測驢的線粒體的特異性基因，即ATPase 6基因，并針對此基因設(shè)計特異性引物。結(jié)果顯示，只有含驢源性成分的肉樣呈陽性，其他不含驢源性成分的樣品呈陰性，表明試驗所使用的引物特異性良好。

通過LAMP方法和SN/T 3730.4—2013實時熒光PCR方法對模擬混合樣品中的驢源性成分進行檢測，LAMP凝膠電泳法的檢測限為0.1%，沉淀可視法檢測限為0.1%，熒光可視法檢測限為0.01%。對85份實際樣品進行檢測，以SN/T 3730.4—2013實時熒光PCR方法為標準對LAMP方法進行評價。最終確定LAMP方法的敏感性為100%，特異性為98.77%，符合率為98.82%。

試驗建立利用LAMP檢測食品中驢源性成分的方法。方法可以準確、快速、靈敏地檢測出食品中驢源DNA，對驢制品摻偽檢測提供技術(shù)支撐和依據(jù)，并可作為市售食品中驢源性成分檢測的有效手段。