趙曉涵，張江濤，李國明，朱艷，谷瑞增，魯軍

中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心（北京 100015）

食物過敏（FA）又稱為食物變態(tài)反應(yīng)，是因?yàn)槿藗兪秤媚撤N食品或食品添加劑后引起的IgE介導(dǎo)或非IgE介導(dǎo)的異常免疫反應(yīng)，從而使人體的組織系統(tǒng)產(chǎn)生多種不良癥狀。任何食物都可能誘發(fā)變態(tài)反應(yīng)，各種食物和制備方法是每個(gè)群體文化特征的一部分，因此引起癥狀的主要食物因地理位置而有所不同[1]。食物過敏原指的是能引起免疫反應(yīng)的食物抗原分子。幾乎所有食物過敏原都是蛋白質(zhì)，大多數(shù)為水溶性糖蛋白，相對分子質(zhì)量為10～70 kDa。食物過敏是一種日益引起人們重視的食品安全問題，也是兒童中最常見的慢性非傳染性疾病[2]。目前尚無治療食物過敏的方法，但在IgE介導(dǎo)的過敏管理方面取得令人興奮的進(jìn)展，包括通過預(yù)期篩查測試，早期引入常見食物過敏原，主動耐受誘導(dǎo)，使用生物制劑和主動風(fēng)險(xiǎn)管理[3]。有學(xué)者開發(fā)口服（OIT），舌下（SLIT）和表皮（EPIT）免疫療法作為食物過敏的積極治療，但沒有人完成3期研究[4]。此外，在高危嬰兒中早期引入可能的食物過敏原以積極預(yù)防食物過敏將是減緩過敏率上升的重要手段[5]。雖然嚴(yán)格避免食用過敏食物是患者的最佳選擇，但食物配料的多樣化及組成的復(fù)雜性，容易發(fā)生過敏原的意外攝入和過敏反應(yīng)[6]，而且患者在長期忌食過敏食物過程中，往往會導(dǎo)致營養(yǎng)缺失，容易發(fā)生病理性飲食行為，對患者及其家庭的生活質(zhì)量產(chǎn)生重大影響[7]。目前主要研究的幾種食物過敏治療策略有望為患者提供治療或長期緩解，但只有降低或消除過敏原的致敏性才是防止食物過敏的根本解決之法。

1 貝類過敏

由于烹飪的原因，甲殼類和軟體動物這2種無脊椎動物通常被稱為貝類。甲殼類動物與蛛形綱動物和昆蟲一起統(tǒng)稱為節(jié)肢動物。在世界范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)5萬多種活甲殼類動物，許多甲殼類動物都可以生吃或熟吃。軟體動物也是一個(gè)龐大而多樣化的群體，細(xì)分為雙殼類、腹足類和頭足類，包括近10萬種不同的物種，包括一些具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的海鮮類，如貽貝、牡蠣、鮑魚和魷魚。貝類種類繁多，因其肉質(zhì)肥嫩、營養(yǎng)豐富而深受消費(fèi)者的喜歡，而且隨著貝類養(yǎng)殖業(yè)、物流業(yè)和冷鏈的發(fā)展，貝類逐漸成為居民食物消費(fèi)的重要組成部分，且消費(fèi)市場不斷擴(kuò)大[8]。

貝類過敏作為食物過敏中的一種，主要是由IgE介導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)引起的Ⅰ型過敏反應(yīng)[9]。過敏原通過攝入、吸入或接觸進(jìn)入機(jī)體后，誘發(fā)B細(xì)胞產(chǎn)生特異性IgE抗體，IgE與肥大細(xì)胞/嗜堿性顆粒細(xì)胞結(jié)合成為致敏靶細(xì)胞。當(dāng)機(jī)體再次接觸相同過敏原刺激時(shí)，過敏原就會與靶細(xì)胞上的IgE結(jié)合發(fā)生特異性反應(yīng)，釋放炎癥因子作用于效應(yīng)組織和器官，從而引發(fā)急性過敏反應(yīng)，如哮喘、蕁麻疹、流涕等[10]。在全球范圍內(nèi)，最常見的致敏貝類是蝦、蟹、龍蝦、蛤、牡蠣和貽貝。據(jù)估計(jì)，貝類過敏的患病率為一般人口的0.5%～2.5%，在中國沿海地區(qū)甚至是內(nèi)陸地區(qū)，食用貝類后引起過敏反應(yīng)的事件逐年增多。

不同貝類可能含有一種或多種過敏原。隨著多種新型貝類過敏原的不斷發(fā)現(xiàn)，已知的貝類過敏原有原肌球蛋白（TM）、精氨酸激酶（AK）、肌球蛋白輕鏈（MLC）、肌鈣結(jié)合蛋白（SCP）、血藍(lán)蛋白亞基（HCS）[11]等，因此，主要對精氨酸激酶AK過敏原進(jìn)行介紹。

2 精氨酸激酶（AK）

精氨酸激酶是貝類中對熱、酸、堿均不穩(wěn)定的過敏原之一，盡管已觀察到一些二聚體AK，但其通常以單體形式被發(fā)現(xiàn)。AK結(jié)構(gòu)復(fù)雜，它由一個(gè)大的C端結(jié)構(gòu)域和一個(gè)小的α螺旋形成的N端結(jié)構(gòu)域組成，C端結(jié)構(gòu)域與Glu合成酶的C端結(jié)構(gòu)域類似，7個(gè)α-螺旋將8股串起來的反平行β-折疊包繞起來。如圖1所示。

圖1 精氨酸激酶三維結(jié)構(gòu)圖

精氨酸激酶是無脊椎動物體內(nèi)主要的磷酸原激酶，參與控制細(xì)胞的ATP水平，在無脊椎動物體內(nèi)有調(diào)節(jié)能量代謝的作用[12]。不同貝類中，甲殼類動物如南美白對蝦、斑節(jié)對蝦、蝦蛄中含量較多；軟體動物如太平洋牡蠣、魷魚、縊蟶及蛤蜊中的相對含量則較少，說明在不同種類貝類中，AK的相對含量有較大區(qū)別[13]。精氨酸激酶在無脊椎動物中分布廣泛，生理功能相似，根據(jù)蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)及相對分子量，可以將精氨酸激酶劃分為三類：單亞基精氨酸激酶，是這三類里目前研究較多的一種，如中國明對蝦、海灣對蝦、鋸緣青蟹、牡蠣中的精氨酸激酶，相對分子量約40 kDa[14-15]；雙亞基精氨酸激酶，如海參、北極貝、深海蛤蜊中的精氨酸激酶為二聚體[16-17]，其相對分子質(zhì)量約80 kDa；四亞基精氨酸激酶，如環(huán)節(jié)動物，相對分子量為150～160 kDa。

泛過敏原是指具有免疫交叉反應(yīng)性結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的一類過敏原[18]，這些過敏原的共同特點(diǎn)是它們在系統(tǒng)進(jìn)化的過程中保持著較高的序列相似性。毛海燕[19]通過RACE的方法成功克隆擬穴青蟹AK的cDNA序列，其編碼357個(gè)氨基酸，氨基酸序列分析結(jié)果表明，擬穴青蟹AK與其他甲殼類AK之間具有較高同源性，經(jīng)軟件分析表明甲殼類精氨酸激酶的活性位點(diǎn)在271～277位（CPTNLGT）氨基酸之間[20]。過去學(xué)者對AK研究主要集中于它在機(jī)體能量代謝調(diào)節(jié)和酶學(xué)性質(zhì)方面的作用，直到2001年，Binder等[21]從102份對玉米面粉蛾過敏的患者血清中發(fā)現(xiàn)其中5份血清具有AK的特異性IgE抗體，證明AK是引起人對玉米面粉蛾過敏的過敏原，同時(shí)指出分子量40 kDa的蟑螂精氨酸激酶與蛾類、塵螨、龍蝦、對蝦、貝類有一定免疫交叉反應(yīng)，說明AK是甲殼類動物、軟體動物甚至昆蟲中的泛過敏原。然而，大多數(shù)交叉反應(yīng)性研究是基于分子和免疫學(xué)發(fā)現(xiàn)，而不一定是基于臨床反應(yīng)性[22]。盡管AK在甲殼類和軟體動物之間的交叉反應(yīng)性被廣泛報(bào)道，但對其分子特性研究還很有限。對AK的分子研究表明，一些AK氨基酸序列的高同源性導(dǎo)致該蛋白的三級結(jié)構(gòu)（蛋白折疊）具有高相似性，從而可能導(dǎo)致交叉反應(yīng)[23-24]。精氨酸激酶作為過敏原的研究尚處于起步階段，Yu等[25]發(fā)現(xiàn)蝦類的新精氨酸激酶過敏原Pen m 2，與過敏血清的反應(yīng)率為33%～39%，該蛋白由359個(gè)氨基酸殘基組成，廣泛存在于各種甲殼類動物中，如蝦、蟹等。García-Orozco等[26]純化太平洋白蝦的精氨酸激酶，并對其擴(kuò)增測序，指出其是首次報(bào)道的太平洋白蝦過敏原，與Pen m 2有96%同源性。

3 精氨酸激酶的致敏性與抗原表位

研究表明，過敏原能夠引發(fā)過敏反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)是抗原表位，也稱為抗原決定簇，指抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán)，一般位于抗原分子的表面?？乖砦荒軌虮惶囟ǖ目贵w或免疫細(xì)胞受體識別，從而引起免疫反應(yīng)。貝類AK引發(fā)的過敏反應(yīng)是由IgE介導(dǎo)產(chǎn)生的，因此國內(nèi)外對貝類AK過敏原表位的研究主要集中于解析其IgE結(jié)合位點(diǎn)[27]。在食物過敏原抗原表位的研究中，一般根據(jù)表位的結(jié)構(gòu)將其分為構(gòu)象型（不連續(xù)型）和線型（連續(xù)型）兩種。深入研究食物過敏原抗原表位可以指導(dǎo)科研人員選擇有效的理化和生物方法來降低甚至消除貝類過敏原的致敏性。過敏原檢測和免疫治療都基于抗原表位，運(yùn)用分子生物學(xué)、蛋白組學(xué)、免疫學(xué)等方法對過敏原中特定氨基酸殘基及其位置進(jìn)行確定，將有利于過敏原檢測和免疫治療[28]。

3.1 構(gòu)象表位與致敏性

構(gòu)象表位是一些在一級結(jié)構(gòu)中不連續(xù)但在空間上相互接近的氨基酸殘基或肽段組成的能被特異性IgE抗體識別的區(qū)域，其致敏性依賴于抗原分子的空間結(jié)構(gòu)[29]。因?yàn)闃?gòu)象表位是通過蛋白質(zhì)折疊產(chǎn)生，所以定位其表位具有挑戰(zhàn)性。某些食物過敏原經(jīng)過加工處理或消化后，蛋白構(gòu)象發(fā)生變化，使蛋白分子內(nèi)部的表位暴露出來，從而易于體內(nèi)抗體識別，或者由于構(gòu)象改變產(chǎn)生新的抗原表位，使其致敏性升高。另一些過敏原經(jīng)過蛋白變性或消化后導(dǎo)致部分或全部構(gòu)象表位被破壞使致敏性下降甚至消失。此外，也有一些過敏原的致敏性不會因加工處理而發(fā)生明顯變化，這是因?yàn)槠淇乖砦患葲]有被破壞也沒有新的抗原表位曝露出來[30]。

3.2 線性表位與致敏性

線性表位，也稱連續(xù)型表位，是在一級結(jié)構(gòu)上連續(xù)的氨基酸殘基或肽段構(gòu)成的能被抗體分子識別結(jié)合的小肽段。許多蛋白在經(jīng)過加工處理后失去原有的構(gòu)象結(jié)構(gòu)，或是在消化后產(chǎn)生的小分子肽段依然具有一定致敏性，所以在食物過敏反應(yīng)中有些線性表位不僅是構(gòu)象表位的組成部分，也能單獨(dú)發(fā)揮作用[31]。

3.3 精氨酸激酶表位與致敏性的研究進(jìn)展

Ayuso等[32]確定凡納濱對蝦中的AK（Lit v 2）過敏原的8個(gè)線性表位（AA：1～18，25～42，64～96，121～141，142～159，160～192，232～255和319～342）。Mao等[33]通過對擬穴青蟹AK的分段表達(dá)，確定2個(gè)主要抗原表位區(qū)域（AA：174～181和253～256），并且通過重疊肽庫技術(shù)確定3個(gè)線性表位（AA：127～141，141～155和21～225），對克氏原螯蝦AK、南美白對蝦AK和章魚AK的構(gòu)象型抗原表位的預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們與擬穴青蟹AK具有相似的構(gòu)象型抗原表位。楊陽[34]通過噬菌體展示技術(shù)結(jié)合重疊肽技術(shù)、細(xì)胞模型確定擬穴青蟹AK的4個(gè)線性表位：L-AK-1（AA 113～127），L-AK-2（AA 127～141），L-AK-3（AA 141～155）和L-AK-4（AA 204～218），應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)結(jié)合LocaPep軟件分析得到擬穴青蟹AK的4個(gè)構(gòu)象表位：C-AK-1（D3A4K43M1A5T49-T44I7），C-AK-2（L31K33V35T32E11E18F14S34D37），C-AK-3（V177G172M173D176Q178T174L181K175L187）和C-AK-4（R202L170Y203E190P205W204L187T206Y145），擬穴青蟹AK致敏性隨空間構(gòu)象的變化而變化，其分子內(nèi)部的Cys201和Cys271形成的二硫鍵是維持空間構(gòu)象的關(guān)鍵位點(diǎn)，并通過小鼠動物模型進(jìn)一步探究r AK1和r AK2的致敏性，確定AK的抗原表位優(yōu)勢區(qū)位于r AK1（AA：87～186）。毛海燕[19]發(fā)現(xiàn)擬穴青蟹AK的抗原表位以構(gòu)象型為主，但血清學(xué)的Western-blotting分析證實(shí)AK中也含有線性表位。對于貝類AK的研究相對于TM而言較少且主要集中在提取純化和分子克隆方面，貝類AK抗原表位的研究處于初始階段。

不同貝類中AK蛋白結(jié)構(gòu)均有所不同，利用不同加工方法或脫敏技術(shù)處理會破壞或修飾AK抗原表位，從而影響其致敏性。研究物理法（熱處理、輻照、超高壓等）、化學(xué)法（糖基化修飾、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、水解等）及生物法（酶解、發(fā)酵、基因突變等）的條件改變與貝類AK抗原表位關(guān)系的報(bào)道更是少之又少。對擬穴青蟹AK進(jìn)行溫度穩(wěn)定性試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)AK為熱不穩(wěn)定蛋白，隨著溫度的升高，分子內(nèi)部氫鍵及次級鍵逐漸被破壞，容易形成聚合物，導(dǎo)致變性、沉淀，因此以構(gòu)象型表位為主的AK過敏原在經(jīng)過高溫處理后致敏性會顯著降低。此外，擬穴青蟹純化AK易被胃蛋白酶降解，對胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的消化穩(wěn)定性較強(qiáng)，但對致敏性的影響仍需深入研究。

4 結(jié)語與展望

有研究者對蟹AK的理化性質(zhì)、消化穩(wěn)定性、抗原表位、致敏性及其關(guān)鍵位點(diǎn)等方面進(jìn)行初步探索，但仍存在一些問題需要深入研究，對其他種類的貝類AK過敏原，如軟體動物AK也需進(jìn)行全面分析研究，完善AK致敏性相關(guān)信息。制備高純度的精氨酸激酶對其功能分析、特異性抗體制備及免疫鑒定顯得尤為重要，只有對AK分子克隆技術(shù)進(jìn)行詳細(xì)探究，獲得具有免疫活性的AK，才能加快AK檢測和治療方面研究；AK的主要表位類型是構(gòu)象表位，但構(gòu)象表位的研究是免疫學(xué)界的難題之一，對食物過敏原構(gòu)象表位的分析多采用噬菌體展示肽庫方法，可將該方法運(yùn)用到研究AK過敏原的試驗(yàn)中，且隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)發(fā)展，有望找到快速繪制AK過敏原結(jié)構(gòu)以及構(gòu)象IgE表位技術(shù)；致敏性評估包括動物和細(xì)胞模型、胃腸道消化試驗(yàn)法、熱穩(wěn)定性試驗(yàn)法等，使用AK致敏性蛋白表位結(jié)構(gòu)與致敏性評估結(jié)合的方法，分析構(gòu)象變化與致敏性關(guān)系，探尋控制AK致敏性和脫敏新技術(shù)；研究不同加工方法對AK的結(jié)構(gòu)及致敏性的影響，優(yōu)化降低AK致敏性加工方法，開發(fā)出低致敏性甚至無致敏性的貝類食品。